劉排 田蔚蔚 李小靜 李志鋒 燕霞 孫建方

RNA干擾趨化因子受體CXCR7基因?qū)谒亓鯩14細(xì)胞侵襲和遷移的影響

劉排 田蔚蔚 李小靜 李志鋒 燕霞 孫建方

目的探討靶向沉默趨化因子受體CXCR7基因?qū)谒亓黾?xì)胞株M14侵襲和遷移能力的影響。方法采用Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)黑素瘤M14和A375細(xì)胞CXCR7蛋白的表達(dá)，選取高表達(dá)CXCR7蛋白的M14細(xì)胞作為研究對(duì)象。將M14細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染CXCR7-siRNA，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA，空白對(duì)照組不做任何處理。采用實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測(cè)CXCR7 mRNA和蛋白在M14細(xì)胞中的表達(dá)水平，Transwell小室法及細(xì)胞劃痕法檢測(cè)干擾前后細(xì)胞侵襲及遷移能力的變化。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組M14細(xì)胞CXCR7 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.412±0.023、0.144±0.005，明顯低于陰性對(duì)照組（1.211±0.117、1）以及空白對(duì)照組（1.000±0.102、1.016±0.004），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為30.068、11 485.5，P值分別為0.001、0.000）。實(shí)驗(yàn)組M14細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)為（20.617±1.503）個(gè)，明顯少于陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照組［（42.000±6.018）個(gè)］和空白對(duì)照組［（43.627±2.152）個(gè)］，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.416，P=0.001）。劃痕實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組每高倍視野（×200）下細(xì)胞遷移數(shù)為15.00±1.10，明顯少于陰性對(duì)照組（44.90±2.20）和空白對(duì)照組（45.30±2.30），3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2 411.945，P=0.000）。結(jié)論靶向沉默CXCR7能顯著抑制黑素瘤M14細(xì)胞的侵襲和遷移，有望為皮膚黑素瘤提供潛在的治療靶點(diǎn)。

黑色素瘤，實(shí)驗(yàn)性；受體，CXCR7；RNA干擾；腫瘤侵潤(rùn)；細(xì)胞遷移分析

我們前期研究表明［1］，皮膚黑素瘤組織及細(xì)胞系中趨化因子受體 7（chemokine receptor 7，CXCR7）表達(dá)升高，可能參與其惡性侵襲與轉(zhuǎn)移過(guò)程。為進(jìn)一步探討CXCR7在皮膚黑素瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，我們通過(guò)RNA干擾技術(shù)，觀察CXCR7對(duì)黑素瘤細(xì)胞侵襲、遷移等生物學(xué)行為的影響。

作者單位：330001南昌，江西省皮膚病?？漆t(yī)院皮膚內(nèi)科（劉排、田蔚蔚）；河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科（李小靜、李志鋒、燕霞）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所病理科（孫建方）

材料與方法

一、主要試劑和儀器

Trizol、G418產(chǎn)自美國(guó)Invitrogen公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒產(chǎn)自美國(guó)Promega公司，黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375、M14細(xì)胞產(chǎn)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC），兔抗人CXCR7多克隆抗體為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品，CytoSelect24孔細(xì)胞移行試驗(yàn)試劑盒為美國(guó)Cell Biolabs公司產(chǎn)品，細(xì)胞計(jì)數(shù)CCK-8（cell counting kit-8）試劑盒為日本同仁株式會(huì)社化學(xué)研究所產(chǎn)品；Transwell小室為美國(guó)Corning公司產(chǎn)品。

二、細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)方法

1．細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞系A(chǔ)375、M14細(xì)胞用含10%胎牛血清的高糖Dulbecco極限必需培養(yǎng)基（Dulbecco′s minimum essential medium，DMEM）培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。

2.Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)黑素瘤M14和A375細(xì)胞CXCR7蛋白表達(dá):采用免疫印跡法檢測(cè)黑素瘤M14和A375細(xì)胞CXCR7蛋白表達(dá)，選擇高表達(dá)CXCR7蛋白的細(xì)胞作為研究對(duì)象。具體檢測(cè)步驟如下：提取兩組細(xì)胞總蛋白，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞后，加入預(yù)冷的蛋白裂解液裂解細(xì)胞，收集上清，提取細(xì)胞總蛋白，Brodford法測(cè)定蛋白含量。取70 μg蛋白上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）垂直電泳、聚亞乙烯雙氧化物（PVDF）轉(zhuǎn)膜，加入一抗（1 ∶400）、二抗（1 ∶5 000），X線曝光、顯影及定影，用CXCR7灰度值與3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）灰度值的比值代表CXCR7蛋白的相對(duì)表達(dá)量。所有內(nèi)參均使用β肌動(dòng)蛋白。每組樣本各重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

3.引物設(shè)計(jì)：基因庫(kù)上查找CXCR7的基因全系列后，Primer zpremier5.0軟件設(shè)計(jì)，通過(guò)使用核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)檢索程序排除其他的可能同源序列。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。CXCR7：上游引物：5′-GCGTCCAACAATGAGACCT ACTG-3′，下游引物：5′-GGCAAAGCCCAAGACAAC GGAGA-3′，目的產(chǎn)物 302 bp。

4.siRNA序列設(shè)計(jì)以及分組：用美國(guó)Ambion公司和德國(guó)Qiagen公司的siRNA設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)siRNA序列，其中CXCR7-siRNA片段正義鏈5′-G GAAAGGAUCAUCUUCUCCATT-3′，反義鏈 5′-UAG GGAAGAAGAUGAUCUUCGG-3′，陰性對(duì)照siRNA片段正義鏈 5′-UUCUUCCGAACGUGUCACCGTT-3′，反義鏈 5′-ACGUUGACACGUUCGGAGGATT-3′。由南京金斯特公司合成雙鏈siRNA編碼序列。將M14細(xì)胞隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染CXCR7-siRNA，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA，空白對(duì)照組不做任何處理。

5．細(xì)胞轉(zhuǎn)染：選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于24孔板，按照Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)孵育48 h后接種于培養(yǎng)瓶。1 000 mg/L的G418濃度為最終確定的篩選濃度，維持該濃度2周進(jìn)行篩選。將篩選的細(xì)胞接種形成克隆，且尚未發(fā)生融合時(shí)，在熒光顯微鏡下挑取克隆，繼續(xù)培養(yǎng)于含G418 500 mg/L的培養(yǎng)基中。

6.實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)M14細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后CXCR7 mRNA的表達(dá)水平：首先應(yīng)用Trizol試劑分別提取總RNA，測(cè)定總RNA的質(zhì)量和濃度，吸光度比值（A260/A280）在1.9～2.1之間為合格，各樣本取大致等量的總RNA，按說(shuō)明書(shū)推薦條件將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物設(shè)計(jì)和合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。CXCR7引物見(jiàn)上。內(nèi)參照β肌動(dòng)蛋白：上游引物5′-GAAGGATTCCTATGTGGG CGAC-3′，下游引物 5′-AGCCTGGATAGCAACGTA CATGG-3′，目的片段268 bp。PCR擴(kuò)增目的基因片段，其反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次，最后72℃再延伸10 min。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，凝膠紫外線成像儀下觀察、拍照，檢驗(yàn)各電泳條帶的灰度值，計(jì)算Gadd45a mRNA/β肌動(dòng)蛋白mRNA比值。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

7.Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)M14細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后CXCR7蛋白的表達(dá)水平：實(shí)驗(yàn)分組同上，取3組實(shí)驗(yàn)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，48 h后提取各組細(xì)胞總蛋白，實(shí)驗(yàn)步驟同前述。

8.Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定轉(zhuǎn)染對(duì)M14細(xì)胞侵襲能力的影響：在每個(gè)Transwell小室的多聚碳酸酯膜上鋪人工基底膜膠（Matrigel），制成人工基底膜。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組M14細(xì)胞，胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)后，以無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整濃度為0.6×106/ml，將Transwell小室置入24孔板中，在小室中加入無(wú)血清培養(yǎng)基，室溫放置2 h，在小室外部加入含10%血清的培養(yǎng)基500 μl，棄去小室內(nèi)部的無(wú)血清培養(yǎng)基，加入300μl細(xì)胞懸液，孵育48h，并在下室中加入10μg/LCXCR7配體CXCL12，作用12 h后棄去小室內(nèi)的上清并輕拭去小室內(nèi)膜多聚碳酸脂膜上的細(xì)胞，小室置入含有500 μl染液的培養(yǎng)孔中染色20 min，顯微鏡下計(jì)數(shù)高倍（×200）視野下穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

9.細(xì)胞劃痕法測(cè)定轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的遷移能力：制備轉(zhuǎn)染前后M14單層細(xì)胞后，用10 μl移液槍槍頭在單層細(xì)胞上呈“一”字劃痕，用PBS清洗3次，孵育24 h后換成含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，孵育24 h后，吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次后，在高倍鏡下計(jì)數(shù)遷移到劃痕區(qū)的細(xì)胞數(shù)目。

10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，作方差齊性檢驗(yàn)，采用方差分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，組間比較采用LSD檢測(cè)，以P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、CXCR7在黑素瘤細(xì)胞中的表達(dá)

CXCR7蛋白在M14和A375細(xì)胞中均有表達(dá)，其表達(dá)值分別為0.649±0.008、0.288±0.004，因此本實(shí)驗(yàn)選擇CXCR7蛋白表達(dá)較高的M14細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究（圖1）。

圖1 黑素瘤細(xì)胞株M14和A375中CXCR7蛋白表達(dá)情況

二、siRNA轉(zhuǎn)染后M14細(xì)胞內(nèi)CXCR7基因、蛋白表達(dá)

經(jīng)過(guò)G418篩選和單克隆挑選后，表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞達(dá)到95%以上，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒或轉(zhuǎn)染帶有shRNA片段的質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞形態(tài)幾乎無(wú)影響。

干擾后實(shí)驗(yàn)組中CXCR7 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.412±0.023，陰性對(duì)照組1.211±0.117，空白對(duì)照組1.000±0.102，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=30.068，P=0.001）。組間比較顯示，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為 0.000、0.002）。

干擾后3組細(xì)胞均不同程度表達(dá)CXCR7，實(shí)驗(yàn)組CXCR7蛋白表達(dá)強(qiáng)度為0.144±0.005，陰性對(duì)照組為1.000±0.002，空白對(duì)照組為1.016±0.004，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11 485.5，P=0.000）。組間比較顯示，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均為0.000）。見(jiàn)圖2。

圖2 免疫印跡法檢測(cè)shRNA干擾后3組黑素瘤細(xì)胞株M14細(xì)胞CXCR7蛋白表達(dá)

三、CXCR12/CXCR7對(duì)黑素瘤細(xì)胞M14細(xì)胞侵襲和遷移的影響

1.siRNA干擾對(duì)M14細(xì)胞侵襲能力的影響：Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示，在10 μg/L CXCL12趨化下，每高倍（×200）視野下遷移穿過(guò)聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)在實(shí)驗(yàn)組為20.617±1.503，陰性對(duì)照組為42.000±6.018，空白對(duì)照組為43.627±2.152，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.416，P=0.001）。組間比較顯示，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.001、0.000）。

2.特異性沉默CXCR7對(duì)人黑素瘤細(xì)胞M14遷移能力的影響：體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的M14細(xì)胞，在10μg/L CXCL12趨化下，單層細(xì)胞劃痕24 h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移數(shù)為15.00±1.10，陰性對(duì)照組為44.90±2.20，而空白對(duì)照組為45.30±2.30，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2 411.945，P=0.000）。組間比較顯示，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均為0.000）。

討 論

研究表明，黑素瘤細(xì)胞系存在多種趨化因子受體及配體共表達(dá)［2］。趨化因子與瘤細(xì)胞表面受體結(jié)合后參與黑素瘤血管形成、瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性過(guò)程［3］。其中黑素瘤細(xì)胞表面表達(dá)CXCR4受體與原位黑素瘤表面潰瘍形成、浸潤(rùn)深度及致死率增高有關(guān)［4］。免疫組化染色顯示，CXCR3在原發(fā)性侵襲性黑素瘤中表達(dá)，且CXCR3陽(yáng)性瘤細(xì)胞浸潤(rùn)深度＞1 mm［5］。體外實(shí)驗(yàn)研究顯示，鼠黑素瘤B16F10細(xì)胞表達(dá)CXCR3及其配體CXCL9、CXCL10，可導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白聚合、侵襲；趨化因子受體CCR7、CCR10、CXCR3和CXCR4高表達(dá)參與黑素瘤淋巴轉(zhuǎn)移。其中CCR10與黑素瘤定向轉(zhuǎn)移皮膚有關(guān)，CXCR3和CXCR4參與黑素瘤肺部定向轉(zhuǎn)移過(guò)程。Lee 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，CXCR7 與受體 CXCL12 結(jié)合后可導(dǎo)致正常人表皮黑素細(xì)胞CXCL12誘導(dǎo)的遷移過(guò)程。研究顯示，在黑素瘤瘤組織及黑素瘤細(xì)胞株A375和M14細(xì)胞中均存在CXCR7蛋白表達(dá)，提示CXCR7可能在黑素瘤生物學(xué)行為中發(fā)揮作用［1］。

CXCR7參與多種腫瘤生長(zhǎng)、生存和轉(zhuǎn)移過(guò)程［7］。研究顯示，CXCR7 在乳腺癌［8］、胰腺癌［9］、甲狀腺乳頭狀癌［10］，前列腺癌［11］等多種腫瘤組織表達(dá)升高，并且靶向沉默肝癌、結(jié)腸癌細(xì)胞株CXCR7表達(dá)后可有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移能力［12-13］；與腫瘤分期、分級(jí)有關(guān)，可促進(jìn)血管生成，參與腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附，增強(qiáng)瘤細(xì)胞侵襲力，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。在前列腺癌中，缺氧誘導(dǎo)因子1a（HIF-1a）誘導(dǎo)CXCR7表達(dá)升高后，激活表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)［14］。CXCR7 在多種人類髓系惡性細(xì)胞系中高表達(dá)，通過(guò)核因子κB（NF-κB）依賴性調(diào)節(jié)，導(dǎo)致絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）p42/44和蛋白激酶B磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞黏附和遷移［15］。

我們通過(guò)RNA干擾技術(shù)阻斷黑素瘤M14細(xì)胞表達(dá)CXCR7，進(jìn)而觀察干擾后細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)生物學(xué)行為的變化。首先利用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)2株黑素瘤細(xì)胞CXCR7蛋白表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，M14細(xì)胞株表達(dá)上調(diào)明顯，故選擇M14細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用RNAi干擾技術(shù)后觀察到細(xì)胞表達(dá)CXCR7基因和蛋白量均明顯下調(diào)。Transwell小室實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，CXCR7-shRNA干擾組到達(dá)聚碳酸酯膜下表面的細(xì)胞數(shù)較兩個(gè)對(duì)照組均明顯下降，表明干擾后在CXCL12趨化下細(xì)胞遷移能力明顯下降。因此推測(cè)，CXCR7參與M14細(xì)胞侵襲遷移過(guò)程以及黑素瘤的惡性侵襲過(guò)程。關(guān)于CXCR7與其配體結(jié)合后激活的具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及相關(guān)分子作用機(jī)制以及與其他趨化因子受體信號(hào)通路之間的交互作用等方面的研究還有待深入。

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Effects of RNA interference targeting the chemokine receptor 7 gene on the invasion and migration of the human melanoma cell line M14

Liu Pai*,Tian Weiwei,Li Xiaojing,Li Zhifeng,Yan Xia,Sun Jianfang.*Department of Dermatology,Jiangxi Province Dermatosis Special Hospital,Nanchang 330001,China

ObjectiveTo explore the effects of targeted silencing of the chemokine receptor 7 （CXCR7）gene on the invasion and migration of the melanoma cell line M14.MethodsWestern-blot analysis was performed to determine the protein expression of CXCR7 in melanoma cell lines M14 and A375,and CXCR7-overexpressing M14 cells were used in this study.Cultured M14 cells were divided into three groups:experimental group transfected with a small interfering RNA（siRNA）targeting CXCR7（CXCR7-siRNA）,negative control group transfected with a negative control siRNA,blank control group receiving no treatment.Real-time quantitative PCR and Western-blot analysis were conducted to determine the mRNA and protein expressions of CXCR7 respectively in M14 cells,Transwell chambers were used to evaluate the invasive activity of M14 cells,and wound healing assay to estimate the migratory activity of M14 cells.ResultsThe experimental group showed significantly decreased mRNA and protein expressions of CXCR7 compared with the negative control group and blank control group（CXCR7 mRNA:0.412±0.023 vs.1.211±0.117 and 1.000±0.102,F=30.068,P=0.001;CXCR7 protein:0.144±0.005 vs.1 and 1.016±0.004,F=11 485.5,P=0.000）.The number of M14 cells crossing the polycarbonate membrane per high-power field（×200）was significantly smaller in the experimental group than in the negative control group and blank control group（20.617±1.503 vs.42.000±6.018 and 43.627 ± 2.152,F=32.416,P=0.001）.Similarly,the number of migrating M14 cells in wound healing assay was significantly decreased in the experimental group compared with the negative control group and blank control group（15.00±1.10 vs.44.90±2.20 and 45.30±2.30,F=2 411.945,P=0.000）.ConclusionTargeted silencing of the CXCR7 gene can significantly inhibit the invasion and migration of M14 cellsin vitro,which may provide a potential target for the treatment of cutaneous melanoma.

Melanoma,experimental;Receptors,CXCR7;RNA interference;Neoplasm invasiveness;Cell migration assays

s:Sun Jianfang,Email:fangmin5758@aliyun.com;Li Xiaojing,Email:zlmdsh@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.12.007

孫建方，Email：fangmin5758@aliyun.com；李小靜，Email：zlmdsh@126.com

2015-02-05）

（本文編輯：尚淑賢）