陳婷 江智茂 于波 馬剛

綠原酸抗人皮膚成纖維細(xì)胞衰老的研究

陳婷 江智茂 于波 馬剛

目的探討綠原酸在乙二醛誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞衰老中的保護(hù)作用。方法使用1 mmol/L乙二醛處理體外培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞，構(gòu)建細(xì)胞衰老模型。用5、10、20、40、80 μmol/L綠原酸和乙二醛共同處理人皮膚成纖維細(xì)胞，MTT法檢測細(xì)胞增殖活性，篩選出綠原酸的有效濃度。1 mmol/L乙二醛分別與有效濃度的綠原酸（10、20、40 μmol/L）共同作用于成纖維細(xì)胞，細(xì)胞衰老β半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測衰老細(xì)胞比例和衰老基因p16INK4a mRNA的表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析和LSD法。結(jié)果與空白對照組人皮膚成纖維細(xì)胞增殖（100%±6.90%）相比，乙二醛可明顯抑制細(xì)胞增殖（55.65%±2.00%），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與乙二醛組細(xì)胞增殖相比，除乙二醛+5 μmol/L綠原酸組（55.36%±2.58%）外，乙二醛+10、20、40、80 μmol/L綠原酸組對細(xì)胞增殖均有不同程度地保護(hù)作用（細(xì)胞增殖率分別為60.75%±1.32%、67.65%±1.90%、75.71%±3.25%、75.69%±2.38%），呈劑量依賴性，40 μmol/L綠原酸達(dá)高峰，80 μmol/L綠原酸與40 μmol/L組相比，細(xì)胞活力的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），因此篩選出綠原酸的有效濃度為10～40 μmol/L。與空白對照組衰老細(xì)胞比例（13.00%±2.22%）比較，加入乙二醛后，衰老細(xì)胞明顯增多（35.65%±2.24%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與乙二醛組細(xì)胞SA-β-gal染色陽性率相比，分別加入10、20、40 μmol/L綠原酸與乙二醛共培養(yǎng)后，細(xì)胞SA-β-gal染色陽性率呈劑量依賴性減少（31.50%±2.13%、22.31%±3.11%、19.32%±3.01%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白對照組衰老基因p16INK4a mRNA的表達(dá)比較，乙二醛組明顯增高（2-ΔΔCt：1.00 ± 0.06 比 0.26 ± 0.05，P＜ 0.01），分別加入 10、20、40 μmol/L 綠原酸與乙二醛共培養(yǎng)后表達(dá)下降（0.88±0.08、0.73±0.06、0.68±0.04，P＜0.05）。結(jié)論綠原酸在乙二醛致人皮膚成纖維細(xì)胞衰老中具有潛在的保護(hù)作用。

皮膚衰老；成纖維細(xì)胞；乙二醛；綠原酸；細(xì)胞衰老；細(xì)胞增殖；p16INK4a mRNA

皮膚衰老的本質(zhì)是皮膚細(xì)胞的衰老。細(xì)胞衰老是指隨著細(xì)胞增殖代數(shù)的增多，細(xì)胞進(jìn)入一個(gè)不可逆的生長停滯狀態(tài)［1］。體外實(shí)驗(yàn)中，利用紫外線、乙二醛、H2O2等應(yīng)激處理可以刺激細(xì)胞提前衰老，被稱為應(yīng)激誘導(dǎo)的提前衰老［2］。具有多種藥理學(xué)作用的綠原酸是否也有延緩皮膚衰老的功能尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)利用1 mmol/L乙二醛作用于成纖維細(xì)胞，建立細(xì)胞衰老模型，通過檢測細(xì)胞衰老指標(biāo)如增殖能力、細(xì)胞衰老β半乳糖苷酶（senescence associatiated-β-galactosidase，SA-β-gal）、衰老基因p16INK4a mRNA的水平，觀察綠原酸對乙二醛誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞衰老模型的保護(hù)作用。

材料和方法

一、試劑與儀器

高糖DMEM培養(yǎng)液（美國HyClone公司），噻唑藍(lán)（MTT）粉劑（美國Gibco公司），鼠抗人波形蛋白抗體、兔抗第8因子抗體、鼠抗角蛋白19抗體（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），TRIzol溶液（美國Invitrogen公司），SA-β-gal染色試劑盒（美國Millipore公司），引物［英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司］，綠原酸（美國Sigma公司），乙二醛［梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司］；倒置熒光顯微鏡、Leica DM4000M正置顯微鏡（德國Leica公司）。

二、體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)分組

選取在北京大學(xué)深圳醫(yī)院泌尿外科行包皮環(huán)切術(shù)切除的兒童包皮組織進(jìn)行皮膚成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)，采用酶消化法分離包皮組織，將分離所得的細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。免疫組化法測定波形蛋白、第8因子相關(guān)抗原和細(xì)胞角蛋白19在細(xì)胞的表達(dá)情況，鑒定完畢后取生長狀況良好的3～8代成纖維細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為：①空白對照組：單純用細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d，不加任何物質(zhì)干預(yù)；②乙二醛損傷組：在細(xì)胞培養(yǎng)系中加終濃度為1 mmol/L乙二醛培養(yǎng)3 d，建立細(xì)胞衰老模型；③綠原酸保護(hù)組：在細(xì)胞培養(yǎng)系中分別加入終濃度為1 mmol/L乙二醛及5、10、20、40、80 μmol/L綠原酸共培養(yǎng)3 d。

三、MTT法檢測細(xì)胞增殖

按6 000個(gè)/孔將細(xì)胞接種在96孔板上，24 h后，按實(shí)驗(yàn)分組加入藥物培養(yǎng)，3 d后加入MTT試劑，孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，二甲基亞砜（DMSO）充分溶解后在酶標(biāo)儀490 nm下測定A值。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。相對細(xì)胞活力=處理組A值/空白對照組A值×100%。

四、SA-β-gal染色法檢測細(xì)胞衰老程度

當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%以上時(shí)，胰酶消化細(xì)胞，細(xì)胞爬片。按實(shí)驗(yàn)分組加入藥物培養(yǎng)，3 d后按說明書進(jìn)行SA-β-gal染色，胞質(zhì)被藍(lán)染的細(xì)胞為衰老細(xì)胞，在正置顯微鏡BF模式下拍照（×200）。SA-βgal陽性率=連續(xù)4個(gè)視野的藍(lán)染細(xì)胞數(shù)/連續(xù)4個(gè)視野下細(xì)胞總數(shù)×100%。

五、qRT-PCR檢測p16INK4a mRNA表達(dá)

按1×105個(gè)/孔將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，按實(shí)驗(yàn)分組加入藥物，3 d后采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測A260與A280，計(jì)算RNA濃度與純度，保存剩余RNA于-80℃冰箱中。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR：總反應(yīng)體系（20 μl）包括反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 cDNA 1.0 μl、熒光染料 SYBR Greenq PCR 10 μl、染料 Rox Reference Dye 和上下游引物分別 0.4 μl、dH2O 7.8 μl。將配制完成的反應(yīng)液離心混勻，放入PCR擴(kuò)增儀。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，1個(gè)循環(huán)；然后57℃退火，延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照基因，分析結(jié)果則使用國際通用的2-ΔΔCt法。引物序列：p16INK4a上游引物 5′-GAAGGTCCCTCAGACATCC CC-3′，下游引物 5′-CCCTGTAGGACCTTCGGTGA C-3′；GAPDH 上游引物 5′-GCACCGTCAAGGCTGA GAAC-3′，下游引物 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGG A-3′。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、人皮膚成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定

鏡下見人皮膚成纖維細(xì)胞狀態(tài)良好，形態(tài)呈梭形，胞核為卵圓形。免疫組化結(jié)果顯示，細(xì)胞表達(dá)波形蛋白，第8因子相關(guān)抗原和細(xì)胞角蛋白19均未見表達(dá)。細(xì)胞形態(tài)及免疫組化的結(jié)果均顯示培養(yǎng)的細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。

二、綠原酸及乙二醛對人皮膚成纖維細(xì)胞增殖能力的影響

如表1所示，各實(shí)驗(yàn)組人皮膚成纖維細(xì)胞增殖能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白對照組相比，乙二醛可明顯抑制細(xì)胞增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與乙二醛組相比，加入5 μmol/L綠原酸對乙二醛抑制成纖維細(xì)胞的增殖沒有明顯影響；從10 μmol/L開始，綠原酸對乙二醛抑制的細(xì)胞增殖有保護(hù)作用，呈劑量依賴性，到濃度為40 μmol/L達(dá)高峰，差異均統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而80 μmol/L綠原酸與40 μmol/L綠原酸相比，細(xì)胞活力的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選用10～40 μmol/L范圍的綠原酸用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

三、綠原酸和乙二醛對皮膚成纖維細(xì)胞SA-βgal表達(dá)的影響

見表1，圖1。各實(shí)驗(yàn)組人皮膚成纖維細(xì)胞SA-β-gal表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白對照組比較，加入乙二醛后，細(xì)胞數(shù)量減少，衰老細(xì)胞明顯增多，衰老陽性率也明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。分別加入10、20、40 μmol/L 綠原酸與乙二醛共培養(yǎng)后，乙二醛誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞衰老有不同程度的抑制，與乙二醛組相比，10～40 μmol/L綠原酸+乙二醛組細(xì)胞SA-β-gal染色陽性率呈劑量依賴性減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中，以40 μmol/L綠原酸保護(hù)作用最為明顯。

表1 綠原酸及乙二醛對人皮膚成纖維細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞衰老β 半乳糖苷酶（SA-β-gal）、p16INK4a mRNA 表達(dá)的影響（±s）

表1 綠原酸及乙二醛對人皮膚成纖維細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞衰老β 半乳糖苷酶（SA-β-gal）、p16INK4a mRNA 表達(dá)的影響（±s）

注：n=3。a：與空白對照組相比，P ＜ 0.01；b：與乙二醛組相比，P ＜ 0.05；c：與乙二醛組相比，P ＜ 0.01；d：與空白對照組相比，P ＜ 0.05

組別 相對細(xì)胞活力（%）p16INK4a mRNA（2-ΔΔCt）空白對照組 100.00±6.90 13.00±2.22 0.26±0.05乙二醛組 55.65±2.00a 35.65±2.24a 1.00±0.06a乙二醛+5 μmol/L綠原酸組 55.36±2.58a - -乙二醛+10 μmol/L綠原酸組 60.75±1.32ab 31.50±2.13ab 0.88±0.08ab乙二醛+20 μmol/L綠原酸組 67.65±1.90ac 22.31±3.11ac 0.73±0.06ab乙二醛+40 μmol/L綠原酸組 75.71±3.25ac 19.32±3.01dc 0.68±0.04ab乙二醛+80 μmol/L綠原酸組 75.69±2.38ac - -F值 70.06 40.62 77.22 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 SA-β-gal陽性率（%）

圖1 綠原酸和乙二醛對皮膚成纖維細(xì)胞SA-β-gal表達(dá)的影響（×200） 1A：空白對照組；1B：乙二醛組，藍(lán)染細(xì)胞增多，細(xì)胞總數(shù)減少；1C～1E：分別為10、20、40 μmol/L綠原酸和乙二醛共培養(yǎng)組，與乙二醛組相比，藍(lán)染細(xì)胞數(shù)逐漸減少，而細(xì)胞總數(shù)逐漸增多

四、綠原酸和乙二醛對皮膚成纖維細(xì)胞p16INK4a mRNA表達(dá)的影響

見表1。qRT-PCR法檢測各組p16INK4a mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白對照組比較，乙二醛可明顯增高衰老基因p16INK4a mRNA的表達(dá)（P＜0.01）。分別加入10、20、40 μmol/L 綠原酸與乙二醛共培養(yǎng)后，p16INK4a mRNA的表達(dá)下降（均P＜ 0.05），但 10、20、40μmol/L 組間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

討 論

采用應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞提前衰老是目前研究細(xì)胞衰老及抗衰老藥物的常用方法。Sejersen 和 Rattan［2］發(fā)現(xiàn)，1 mmol/L乙二醛作用于皮膚成纖維細(xì)胞3 d，細(xì)胞增殖活性明顯下降，SA-β-gal表達(dá)量明顯上升，晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）合成增多，從而建立細(xì)胞衰老模型。這種方法不僅可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞發(fā)生衰老改變，而且在皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中也有同樣的發(fā)現(xiàn)［3］。目前利用乙二醛誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老模型在抗皮膚衰老藥物的研究中得到廣泛應(yīng)用［4］。其機(jī)制可能與乙二醛活躍的性質(zhì)有關(guān)，其α醛基與蛋白質(zhì)有高反應(yīng)性，可與精氨酸、賴氨酸、半胱氨酸發(fā)生反應(yīng)生成AGE，而AGE的不斷累積是導(dǎo)致皮膚發(fā)生衰老的重要機(jī)制之一［5-7］。

目前尚無一種特異性的標(biāo)志物界定細(xì)胞處于衰老狀態(tài)，需從多角度綜合分析［8］。MTT實(shí)驗(yàn)通過存活細(xì)胞數(shù)間接揭示細(xì)胞增殖能力。SA-β-gal染色實(shí)驗(yàn)是判斷細(xì)胞衰老的重要方法，其原理可能與衰老細(xì)胞中溶酶體β-半乳糖苷酶表達(dá)增多有關(guān)［9］。p16INK4a是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑基因，在調(diào)控細(xì)胞衰老過程中扮演關(guān)鍵作用。p16INK4a在皮膚中的含量與年齡有顯著的線性關(guān)系，其在衰老皮膚的含量是年輕皮膚的7倍［10］，因此p16INK4a也被稱為衰老基因。本實(shí)驗(yàn)選用以上3種方法綜合判斷細(xì)胞是否處于衰老狀態(tài)。在本實(shí)驗(yàn)中，加入乙二醛后，細(xì)胞的增殖活性明顯下降，SA-β-gal表達(dá)增多，p16INK4a mRNA表達(dá)量上升，表明乙二醛可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。

綠原酸在咖啡、水蜜桃、綠茶等食物中含量豐富，也是杜仲和金銀花的有效活性成分。但目前尚未能對綠原酸進(jìn)行化學(xué)合成。國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，綠原酸有許多生物活性，如抗氧化、抗炎、抗病毒、降血壓等［11-12］。Kim 等［13］在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，綠原酸可抑制AGE合成，阻礙膠原蛋白與AGE之間交聯(lián)形成。本研究MTT實(shí)驗(yàn)顯示，與乙二醛組相比，10～40 μmol/L綠原酸對細(xì)胞增殖的保護(hù)作用呈劑量依賴性，而濃度為5 μmol/L時(shí)沒有明顯效果，濃度為80 μmol/L與40 μmol/L之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。據(jù)此，我們選用10、20、40 μmol/L為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。10～40 μmol/L綠原酸與乙二醛共孵育成纖維細(xì)胞后，細(xì)胞SA-β-gal陽性率均明顯低于乙二醛組，但仍高于空白對照組。p16INK4a mRNA表達(dá)情況與MTT、SA-β-gal實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，再次證明了綠原酸對成纖維細(xì)胞的保護(hù)作用。以上結(jié)果均說明綠原酸能對抗乙二醛誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞衰老，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，推測保護(hù)機(jī)制可能是綠原酸阻礙了乙二醛向AGE發(fā)展，減少AGE帶來的損傷。

綜上所述，利用乙二醛可以重建成纖維細(xì)胞衰老模型。在該衰老上加入綠原酸后，細(xì)胞增殖能力，SA-β-gal及p16INK4a mRNA表達(dá)均有改善，提示綠原酸在乙二醛致成纖維細(xì)胞衰老中具有潛在的保護(hù)作用。

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Inhibitory effect of chlorogenic acid on senescence of human skin fibroblasts

Chen Ting*,Jiang Zhimao,Yu Bo,Ma Gang.*Department of Dermatology,Shenzhen Maternity and Child Healthcare Hospital,Shenzhen 518000,China

ObjectiveTo evaluate the inhibitory effect of chlorogenic acid on senescence of human skin fibroblasts （HSFs）.MethodsFibroblasts isolated from human foreskin were treated with 1 mmol/L glyoxalin vitroto develop a model for cellular senescence.In order to select effective concentrations of chlorogenic acid,some HSFs were treated with 1 mmol/L glyoxal alone or in combination with chlorogenic acid at different concentrations（5,10,20,40,80 μmol/L）for 3 days,with those receiving no treatment serving as the blank control group.Then,methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）assay was performed to evaluate the proliferative activity of HSFs.Some HSFs were divided into 5 groups to be cultured alone（blank control group）,or treated with 1 mmol/L glyoxal（glyoxal group）or the combination of 1 mmol/L glyoxal and chlorogenic acid at effective concentrations of 10,20 and 40 μmol/L （glyoxal+chlorogenic acid groups）.Senescence associated β-galactosidase （SA-β-gal）staining and real-time fluorescence-based quantitative PCR were conducted to determine the percentage of senescent cells and expression level of p16INK4a mRNA respectively.Statistical analysis was carried out by one-way analysis of variance followed by the least significant difference（LSD）-ttest.ResultsCompared with the blank control group,the glyoxal group showed significantly decreased cellular proliferative activity of HSFs（55.65% ±2.00%vs.100% ±6.90%,P＜0.01）,while chlorogenic acid increased the proliferative activity of HSFs in a dose-dependent manner,and the increase reached a peak at 40 μmol/L.Concretely speaking,the glyoxal+10-,20-,40-,80-μmol/L chlorogenic acid groups all significantly differed from the glyoxal group in cellular proliferative activity（60.75%±1.32%,67.65%±1.90%,75.71%±3.25%and 75.69%±2.38%vs.55.65%± 2.00%,allP＜ 0.05）,but no significant difference was observed between the glyoxal group and glyoxal+5-μmol/L chlorogenic acid group or between the glyoxal+40-μmol/L chlorogenic acid group and glyoxal+80-μmol/L chlorogenic acid group （bothP＞ 0.05）.Therefore,10-40 μmol/L was selected as the effective concentrations of chlorogenic acid.The glyoxal group showed significant increases in the percentage of senescent（SA-β-gal-positive）cells （35.65% ±2.24%vs.13.00%±2.22%,P＜0.01）and expression level of p16INK4a mRNA （2-ΔΔCt:1.00±0.06 vs.0.26±0.05,P＜0.01）compared with the blank control group,while the glyoxal+10-,20-,40-μmol/L chlorogenic acid groups showed significantly decreased percentage of senescent cells（31.50%±2.13%,22.31%±3.11%and 19.32%±3.01%respectively）and expression level of p16INK4a mRNA （2-ΔΔCt:0.88 ± 0.08,0.73 ± 0.06 and 0.68 ± 0.04 respectively）compared with the glyoxal group （allP＜0.05）.Additionally,the percentage of senescent cells decreased with the increase in chlorogenic acid concentrations in the glyoxal+chlorogenic acid groups.ConclusionChlorogenic acid can protect HSFs from glyoxal-induced senescence.

Skin aging;Fibroblasts;Glyoxal;Chlorogenic acid;Cell aging;Cell proliferation;p16INK4a mRNA

Ma Gang,Email:szmagang@medmail.com.cn

作者單位：518000深圳市婦幼保健院皮膚科（陳婷）；北京大學(xué)深圳醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室（江智茂），皮膚科（馬剛、于波）

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.12.005

馬剛，Email：szmagang@medmail.com.cn

2015-09-07）

（本文編輯：周良佳 顏艷）