吳秀娟 趙宗峰 普雄明

Kaposi肉瘤相關(guān)皰疹病毒8型相關(guān)微小RNA k12-1和k12-12在Kaposi肉瘤組織中的表達(dá)及意義

吳秀娟 趙宗峰 普雄明

目的檢測(cè)Kaposi肉瘤腫瘤組織中Kaposi肉瘤相關(guān)皰疹病毒8型相關(guān)微小RNA k12-1（kshvmiR-k12-1）和k12-12（kshv-miR-k12-12）的表達(dá)，并探討其與Kaposi肉瘤病理分期、HIV感染、人皰疹病毒8型（HHV-8）感染、皮損面積之間的關(guān)系。方法選取液氮保存的Kaposi肉瘤腫瘤組織和瘤旁正常組織18對(duì)，采用Trizol法提取標(biāo)本組織中的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR法定量檢測(cè)kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12，比較Kaposi肉瘤腫瘤組織及其瘤旁組織中kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12表達(dá)的差異，并分析其與Kaposi肉瘤病理分期、HIV和HHV-8感染、皮損面積之間的關(guān)系。結(jié)果kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12在Kaposi肉瘤腫瘤組織中的2-△△Ct值分別為（1.016±1.645）和（2.104± 1.973），明顯高于瘤旁正常組織，分別為 0.029± 0.019（t=2.542，P=0.016）和 0.102± 0.093（t=4.301，P=0.000）。不同HIV和HHV-8感染狀態(tài)、病理分期、皮損面積患者的kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)論kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12在Kaposi肉瘤腫瘤組織中呈明顯高表達(dá)，但與HIV感染、HHV-8感染、病理分期及皮損面積無(wú)明顯相關(guān)。

肉瘤，卡波西；皰疹病毒8型，人；kshv-miR-k12-1；kshv-miR-k12-12

研究顯示，在Kaposi肉瘤中共有17條Kaposi肉瘤相關(guān)皰疹病毒8型（Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）相關(guān)微小 RNAs，由 12 個(gè)基因編碼，易在潛伏感染細(xì)胞中被檢測(cè)出來(lái)，并參與細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)［1-2］。K12基因是一個(gè)潛伏基因，在 KSHV 裂解復(fù)制期激活［3］，研究表明［4］，kshvmiR-k12-3和kshv-miR-k12-7誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素6（IL-6）和IL-10，表明這兩個(gè)miRNA參與免疫反應(yīng)，從而影響KSHV相關(guān)腫瘤的進(jìn)展，但kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12在Kaposi肉瘤中的表達(dá)及意義尚不明確。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)18對(duì)Kaposi肉瘤腫瘤組織和瘤旁正常組織中kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12的表達(dá)，探討kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12與Kaposi肉瘤臨床分型、病理類型、人皰疹病毒 8 型（human herpesvirus 8，HHV-8）感染、皮損面積之間的關(guān)系。

作者單位：830001烏魯木齊，新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科（吳秀娟、普雄明），臨床醫(yī)學(xué)研究中心（趙宗峰）

資料與方法

1.樣本來(lái)源及資料收集：組織樣本來(lái)自2012年1月至2013年9月在我院就診的Kaposi肉瘤患者腫瘤和瘤旁組織，手術(shù)切除后立即于液氮中儲(chǔ)存。所有標(biāo)本均經(jīng)組織病理檢查，由兩名高年資病理醫(yī)生確診為Kaposi肉瘤。對(duì)入選的所有病例完善其臨床資料及相關(guān)檢查結(jié)果，包括性別、年齡、HIV及HHV-8感染情況、病理分期、皮損面積。本研究已通過(guò)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，患者均已簽署知情同意書(shū)。

2.主要試劑與儀器：cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Epicentre公司），miScript SYBR熒光定量PCR試劑盒（德國(guó)Qiagen公司），一抗為鼠抗人HHV-8單克隆抗體（英國(guó)Abcam公司），二抗（丹麥Dako公司）。所有引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。NanoDrop? ND-1000（美國(guó) NanoDrop公司），SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR（美國(guó)Applied Biosystems公司）。

3.提取組織中的總RNA：取-80℃凍存的Kaposi肉瘤腫瘤組織和瘤旁正常組織約20 mg，加入Trizol 1 ml，冰浴中用電動(dòng)勻漿器進(jìn)行勻漿，然后按總RNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。取1 μl RNA進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，同時(shí)取 1 μl RNA用 NanoDrop? ND-1000測(cè)定RNA濃度和純度，本次實(shí)驗(yàn)所有標(biāo)本A260/A280均為1.7～2.0，說(shuō)明RNA純度高。

4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR：根據(jù)cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系（20 μl）包括緩沖液 2 μl、MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶 0.2 μl、總 RNA 700 ng、RNA 酶抑制劑 0.3 μl、dNTP 2μl、莖環(huán)引物0.3 μl，加入去 RNA 酶水至 20 μl。反應(yīng)條件：16 ℃30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，完成后 cDNA 貯存于-20℃?zhèn)溆谩shv-miR-k12-1莖環(huán)引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTG CACTGGATACGACGCTTAC-3′；kshv-miR-k12-12莖環(huán)引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGG AGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCAACCA-3′；內(nèi)參U6莖環(huán)引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCG TGTCAT-3′。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)體系（10 μl）包括：熒光染料反應(yīng)液5 μl，上、下游引物各1 μl，cDNA 2 μl，加水至總體積為 10 μl。反應(yīng)條件：95 ℃10 min；40 個(gè) PCR 循環(huán) （95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s）。kshv-miR-k12-1實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物（上游：5′-GGGGATTACAGGAAACTGGGT，下游 5′-GTGCGTG TCGTGGAGTCG-3′），擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 65 bp。kshvmiR-k12-12實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物（上游：5′-AATGGGGGAGGGTGCC-3′，下游 5′-GTGCGTGTCG TGGAGTCG-3′），擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 62 bp。U6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物（上游：5′-GCTTCGGCAGCACATA TACTAAAAT-3′，下游 5′-CGCTTCACGAATTTGCG TGTCAT-3′），擴(kuò)增產(chǎn)物大小為89 bp。本實(shí)驗(yàn)采用2-△△Ct法分析表達(dá)量大小，用 2-△△Ct值計(jì)算 kshvmiR-k12-1和kshv-miR-k12-12的相對(duì)表達(dá)量。

5.HHV-8免疫組化染色：采用Envision二步法，一抗工作液稀釋濃度為1∶50，選擇PCR擴(kuò)增HHV-8基因陽(yáng)性的組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS緩沖液代替一抗作為空白對(duì)照。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，數(shù)據(jù)比較采用方差分析，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和配對(duì)t檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.臨床資料：Kaposi肉瘤患者18例，男17例，女1例，維吾爾族；病理分期：斑片期6例，斑塊期3例，結(jié)節(jié)期9例；皮損面積≤1%6例，＞1%～5%5例，＞5%～10%5例，＞10%～30%2例。分型：經(jīng)典型 11例，發(fā)病年齡（64.9±11.0）歲，病程（36.3±39.1）個(gè)月，HHV-8感染（HHV-8免疫組化陽(yáng)性）9例；艾滋?。ˋIDS）相關(guān)型7例，發(fā)病年齡（47.6±11.9）歲，病程（5.3±2.8）個(gè)月，HHV-8感染（HHV-8免疫組化陽(yáng)性）6例。

2.Kaposi肉瘤腫瘤組織和瘤旁正常組織中kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12的表達(dá)：kshv-miR-k12-1、kshv-miR-k12-12和內(nèi)參 U6的熔解曲線均呈單峰狀，說(shuō)明熒光分別由目標(biāo)產(chǎn)物kshv-miR-k12-1、kshv-miR-k12-12和內(nèi)參 U6發(fā)出，特異性好。18例Kaposi肉瘤腫瘤組織中kshvmiR-k12-1表達(dá)量（2-△△Ct）為1.016±1.645，瘤旁正常組織為0.029±0.019，其表達(dá)倍數(shù)（腫瘤/瘤旁）為35.03，經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.542，P=0.016）。kshv-miR-k12-12 的平均表達(dá)量（2.104±1.973）明顯高于瘤旁正常組織（0.102±0.093），其表達(dá)倍數(shù)（腫瘤/瘤旁）為 20.62。經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.301，P=0.000）。

3.Kaposi肉瘤中 kshv-miR-k12-1和 kshvmiR-k12-12的表達(dá)與臨床表現(xiàn)的關(guān)系：經(jīng)單因素方差分析或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，不同HIV和HHV-8感染狀態(tài)、病理分期、皮損面積患者的kshv-miR-k12-1表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

討 論

miRNA作為轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵因子，對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展有重要作用［5］。Kaposi肉瘤的病因一直未能確定，目前HHV-8被公認(rèn)為是其致病因子［6-7］。Kaposi肉瘤相關(guān)皰疹病毒分為裂解期和潛伏期兩個(gè)周期，潛伏期時(shí)一小部分病毒基因表達(dá)，包括kaposin基因、病毒Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域樣白介素1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白（vFLIP）、病毒細(xì)胞周期蛋白（vCYC）、潛伏相關(guān)核抗原（LANA）和12個(gè)miR-k12-1到miR-k12-12的前體miRNA，這些前體miRNA可以產(chǎn)生24個(gè)成熟 miRNA［8-9］。成熟miRNA均來(lái)自KSHV潛伏期位點(diǎn)，共有一個(gè)啟動(dòng)子，基本上表達(dá)所有KSHV感染的細(xì)胞［10-13］。miR-k12-12 完全保守，miR-k12-1、3、8、10 和 11 高度保守，miR-k12-2、4、5、6、7 和 9 具有相對(duì)明顯的多態(tài)性。

表1 18例Kaposi肉瘤腫瘤組織中kshv-miR-K12-1、kshv-miR-k12-1表達(dá)量與臨床參數(shù)的關(guān)系

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)18對(duì)維吾爾族Kaposi肉瘤患者腫瘤和瘤旁正常組織中kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，這兩條miRNA在Kaposi肉瘤腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于瘤旁正常組織，提示kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12可能與Kaposi肉瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Catrina Ene等［14］檢測(cè)17個(gè)4%甲醛包埋的Kaposi肉瘤標(biāo)本和3個(gè)KSHV陰性正常石蠟包埋組織標(biāo)本kshv-miR-k12-1，結(jié)果顯示，kshvmiR-K12-1在Kaposi肉瘤中表達(dá)明顯上調(diào)。Hansen等［15］研究結(jié)果顯示，kshv-miR-k12-1 在 Kaposi肉瘤中明顯高表達(dá)。本研究與上述研究結(jié)果一致，更加肯定了kshv-miR-k12-1參與了Kaposi肉瘤的發(fā)生發(fā)展。采用多個(gè)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)骨橋蛋白（SPP1）、塑性相關(guān)基因1（PRG1）、整膜蛋白2A（ITM2A）、S100 鈣結(jié)合蛋白 A2（S100A2）和血小板反應(yīng)蛋白1（THBS1）結(jié)合在KSHV miRNA3′UTR區(qū)，是kshv-miR-k12-1調(diào)控的靶基因。尤其是THBS1受多個(gè)KSHV miRNA調(diào)控，如kshv-miR-k12-1、kshv-miR-k12-3-3p、kshv-miR-k12-6-3p和 kshv-miR-k12-11。Samols等［16］研究證實(shí)，KSHV miRNA 抑制 SPP1、PRG1和 THBS1的3′UTR區(qū)，表明這些基因受KSHV miRNA表達(dá)的影響而發(fā)生改變。Suffert等［17］研究顯示，KSHV miRNA 下調(diào)內(nèi)源性Casp3 水平，表明 Casp3 3′UTR 受 kshv-miR-k12-1，kshv-miR-k12-3和kshv-miR-k12-4-3p的調(diào)控。

本研究還分析了kshv-miR-k12-1和kshvmiR-k12-12的表達(dá)與Kaposi肉瘤HHV-8感染、HIV感染、病理分期及皮損面積之間的關(guān)系，結(jié)果未見(jiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12表達(dá)量可能與HHV-8感染、HIV感染、病理分期及皮損面積無(wú)關(guān)，也可能與本研究Kaposi肉瘤標(biāo)本數(shù)量較少有關(guān)，此結(jié)果在國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究中尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究證實(shí)，kshv-miR-k12-1和kshv-miR-k12-12與Kaposi肉瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其功能和調(diào)控的靶基因尚未明確，有待進(jìn)一步研究。

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Expressions of Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus type 8-associated microRNAs k12-1 and k12-12 in Kaposi′s sarcoma and their significance

Wu Xiujuan*,Zhao Zongfeng,Pu Xiongming.*Department of Dermatovenereology,People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi 830001,China

ObjectiveTo measure the expressions of Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus type 8 associatedmicroRNAs k12-1 （kshv-miR-k12-1）and k12-12 （kshv-miR-k12-12）in Kaposi′s sarcoma tissue,and to assess their relationship with pathological stage and lesion area of Kaposi′s sarcoma,HIV infection,and human herpesvirus type 8（HPV-8） infection.MethodsTotally,18 paired tissue specimens stored in liquid nitrogen from Kaposi′s sarcoma lesions and paralesional skin were collected.Total RNAs were extracted from these specimens by using Trizol reagent,and reversely transcribed into cDNA.SYBR Green real-time fluorescence-based quantitative PCR was performed to measure the expressions of kshv-miR-k12-1 and kshv-miR-k12-12 in these specimens.The relationship of kshv-miR-k12-1 and kshv-miR-k12-12 expressions with the pathological stage and lesion area of Kaposi′s sarcoma,HIV and HPV-8 infections was analyzed.ResultsCompared with paralesional normal skin,Kaposi′s sarcoma lesions showed significantly increased expressions of kshv-miR-k12-1 （2-△△Ct:1.016 ± 1.645 vs.0.029 ± 0.019,t=2.542,P=0.016）and kshv-miR-k12-12（2-△△Ct:2.104 ± 1.973 vs.0.102 ± 0.093,t=4.301,P=0.000）.There were no significant differences in the expressions of kshv-miR-k12-1 or kshv-miR-k12-12 between patients with HIV or HPV-8 infection and those without,among patients with different pathological stages of Kaposi′s sarcoma,or among patients with different lesion areas （allP＞ 0.05）.ConclusionBoth kshv-miR-k12-1 and kshv-miR-k12-12 are highly expressed in Kaposi′s sarcoma,but neither of their expressions is related to HIV or HPV-8 infection,pathological stage or lesion area of Kaposi′s sarcoma.

Sarcoma,Kaposi;Herpesvirus 8,human;kshv-miR-k12-1;kshv-miR-k12-12

Pu Xiongming,Email:puxiongming@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.12.008

國(guó)家自然科學(xué)基金（81260311）；新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（2014211A059）

普雄明，Email：puxiongming@126.com

2015-01-12）

（本文編輯：周良佳 顏艷）