楊珮珮 彭晶 于作忠 施歌 黎兆軍 張國學 樊翌明

對稱性肢端角化病皮損中脂肪酸結(jié)合蛋白5及二氫硫辛酰胺脫氫酶表達

楊珮珮 彭晶 于作忠 施歌 黎兆軍 張國學 樊翌明

目的探討脂肪酸結(jié)合蛋白5（FABP5）及二氫硫辛酰胺脫氫酶（DLD）在對稱性肢端角化病中的表達和意義。方法收集9例對稱性肢端角化病患者腕部皮損及其周圍皮膚活檢標本，9例健康人腕部皮膚為對照，用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）及免疫組化法檢測FABP5及DLD表達水平。結(jié)果RT-PCR顯示，F(xiàn)ABP5 mRNA及DLD mRNA表達在對稱性肢端角化病患者腕部皮損、皮損周圍皮膚、健康人腕部皮膚3組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。免疫組化顯示，對稱性肢端角化病皮損中FABP5陽性染色范圍和強度增加，角質(zhì)層、顆粒層、棘層均有強染色；而皮損周圍皮膚中角質(zhì)層、顆粒層及棘層弱陽性染色，健康對照皮膚中僅有棘層和基底層弱陽性染色。對稱性肢端角化病皮損中DLD表達減少，僅在角質(zhì)層和少數(shù)病例棘層表達；皮損周圍及健康人皮膚表皮全層均有DLD陽性染色，胞核、胞質(zhì)均呈深棕色。結(jié)論對稱性肢端角化病皮損中FABP5高表達可能參與角質(zhì)形成細胞異常分化過程，而DLD表達下調(diào)提示存在能量代謝失衡。

角化?。恢舅峤Y(jié)合蛋白質(zhì)類；二氫硫辛酰胺脫氫酶；對稱性肢端角化病

對稱性肢端角化?。╯ymmetrical acrokeratoderma，SAK）是我國學者姜袆群等［1］、朱曉浚等［2］于2008年首次報道并命名的一種皮膚病。樊翌明等［3］于2010年首次在國際上以“獲得性SAK”為名報道了2例，并對國內(nèi)報道的27例進行了總結(jié)。目前國際皮膚科學界已認可SAK是一種新的皮膚?。?］。迄今國內(nèi)共報道了212例SAK，國外未見報道［5-8］。SAK病因與發(fā)病機制不明。我們發(fā)現(xiàn)SAK皮損中炎癥細胞明顯增多［5］，而李常興等［6］的研究顯示，SAK 皮損中存在屏障功能受損。在前期的蛋白組學研究中，我們發(fā)現(xiàn)SAK皮損中脂肪酸結(jié)合蛋白5（fatty acid binding protein 5，F(xiàn)ABP5）表達明顯高于正常皮膚，而二氫硫辛酰胺脫氫酶（dihydrolipoamide dehydrogenase，DLD）表達明顯降低。FABP5是一個脂質(zhì)載體，能結(jié)合轉(zhuǎn)運脂肪酸，參與多種生物過程［9］，在正常皮膚中表達較低［9-10］，在銀屑病皮損中過度表達［11］。DLD是線粒體多酶復合物的共同黃素蛋白組分，參與氧化還原反應(yīng)，維持能量代謝平衡［12］。DLD缺乏或基因突變多引起代謝性疾病［13］，在正常皮膚中表達迄今未見報道。我們擬用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和免疫組化技術(shù)，進一步驗證SAK皮損、皮損周圍皮膚和健康人皮膚中FABP5 mRNA和DLD mRNA及蛋白表達差異，為今后進行基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

作者單位：524001湛江，廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院皮膚科［楊珮珮（現(xiàn)在湖北省荊門市第二人民醫(yī)院皮膚科，448000）、彭晶、于作忠、施歌、黎兆軍、張國學、樊翌明］

對象和方法

一、對象

2009年9月至2014年11月，對9例SAK患者腕部皮損進行活檢，其中男8例，女1例，年齡20～37（25.67±5.94）歲，發(fā)病年齡 13～24（18.89±3.26）歲。SAK診斷根據(jù)臨床特征和病理檢查［1-3］，9例均在肢端部位發(fā)生對稱性褐色角化性斑片，特別是手背、腕、踝部，掌跖不受累。皮損在浸水或出汗幾分鐘后變白，干燥后恢復原狀。皮損夏季出現(xiàn)，冬季減輕或消退。皮損組織病理檢查顯示，表皮角化過度，棘層增厚，輕度乳頭瘤樣增生，真皮淺層血管周圍稀疏淋巴樣細胞浸潤。9例腕部正常皮膚取自本機構(gòu)學生及醫(yī)生志愿者，男6例，女3例，年齡15～53（27.33±10.59）歲。兩組年齡差異無統(tǒng)計學意義（t=0.412，P=0.686）?；顧z標本分別用液氮冷凍及4%甲醛固定。本研究經(jīng)廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會審查批準，所有受檢者均簽署了知情同意書。

二、方法

1.RT-PCR：人FABP5、DLD和GAPDH引物序列采用Primer 3軟件設(shè)計，由生工生物工程（上海）有限公司合成：FABP5：上游引物5′-TCAGCAGCTG GAAGGAAGAT-3′和下游引物 5′-CTTTCCTTCCCA TCCCACTC-3′；DLD：上游引物 5′-GCTCTTCTGGTG GTAAAGC-3′和下游引物 5′-GGATCTTCACCATGC CATCT-3′；GAPDH：上游引物 5′-CGAGATCCCTCC AAAATCAA-3′和下游引物 5′-GTCTTCTGGGTGGC AGTGAT-3′。液氮保存皮膚標本加入Trizol試劑（美國Invitrogen公司）提取總RNA，再用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］合成cDNA及S1000TMThermal Cycler PCR儀（美國Bio-Rad公司）進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體積為20 μl，反應(yīng)體系為Premix Ex TaqTMⅡ（2×）［寶生物工程（大連）有限公司］10.0 μl，PCR 混合引物（10 μmol/L）1 μl，cDNA 模板 1 μl，加滅菌蒸餾水至 20 μl。擴增條件為：98℃預(yù)變性 5 min，98℃變性 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30～40個循環(huán)，72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP公司）觀察、拍照，再用Image J系統(tǒng)檢測灰度值，計算FABP5、DLD mRNA灰度值與GAPDH mRNA灰度值之比。

2.免疫組化檢測：兔抗人 FABP5（sc-50379）及DLD（sc-135027）多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），即用型免疫組化EliVisionTMplus試劑盒（KIT-9902）、加強型 DAB 顯色試劑盒（DAB-2031）（福州邁新生物技術(shù)公司）。石蠟切片（厚度3 μm）脫蠟、水化，采用檸檬酸鹽高溫高壓法修復抗原，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶；滴加一抗（工作濃度1∶200），4℃孵育過夜后室溫孵育2 h；EliVisionTMplus試劑盒處理后DAB顯色。以PBS替代一抗作為陰性對照，每張切片隨機選擇10個不同視野（×400），觀察染色范圍及染色強度。染色范圍指陽性染色細胞占各層細胞比例：0（-），1% ～ 25%（+），26% ～ 50%（++），51% ～ 75%（+++），76% ～ 100%（++++）。染色強度指陽性染色顆粒顏色：陰性（-），淡黃色（+），棕黃色（++），深棕色（+++），棕黑色（++++）。

3.統(tǒng)計學方法：采用方差分析及LSD檢驗（方差齊）或Dunnett T3檢驗（方差不齊）。

結(jié) 果

一、RT-PCR檢測FABP5和DLD mRNA表達

RT-PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)ABP5和DLD mRNA在SAK皮損、皮損周圍皮膚和健康對照皮膚中的表達差異無統(tǒng)計學意義（圖1、表1）。

二、免疫組化染色

圖1 對稱性肢端角化病（SAK）皮損中脂肪酸結(jié)合蛋白5（FABP5）及二氫硫辛酰胺脫氫酶（DLD）mRNA RT-PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳 3組皮膚中FABP5、DLD mRNA表達無明顯差異

表1 各組皮膚中脂肪酸結(jié)合蛋白5（FABP5）及二氫硫辛酰胺脫氫酶（DLD）mRNA表達水平（±s）

表1 各組皮膚中脂肪酸結(jié)合蛋白5（FABP5）及二氫硫辛酰胺脫氫酶（DLD）mRNA表達水平（±s）

注：表達水平為FABP5、DLD mRNA灰度值與GAPDH mRNA灰度值之比

組別 例數(shù) FABP5 DLD對稱性肢端角化病皮損 9 0.651±0.625 0.499±0.572皮損周圍皮膚 9 0.321±0.353 0.677±0.799健康對照皮膚 9 0.358±0.359 0.642±0.615 F值 1.375 0.179 P值 ＞0.05 ＞0.05

1.FABP5：FABP5陽性染色主要為胞質(zhì)著色，少數(shù)可見胞核染色。SAK皮損中FABP5染色均為強陽性（圖2A），著色主要見于角質(zhì)層、顆粒層及棘層，基底層僅1例陽性染色，陽性細胞數(shù)約占棘層75%～100%。皮損周圍染色為弱陽性或陰性（圖2B），陽性著色見于角質(zhì)層、顆粒層及棘層，陽性細胞數(shù)約占各層25%～50%。健康對照皮膚染色為弱陽性或陰性（圖2C），陽性著色主要見于棘層與基底層，陽性細胞數(shù)約占各層25%～50%，少數(shù)完全為陰性。所有標本可見小汗腺導管內(nèi)層胞質(zhì)著色，部分標本可見毛囊皮脂腺染色。SAK皮損、皮損周圍及健康對照皮膚中真皮淺層均有少量浸潤細胞表達FABP5。見表2。

2.DLD免疫組化染色結(jié)果：SAK皮損（圖3A）、皮損周圍（圖3B）及健康對照皮膚（圖3C）中DLD染色均為陽性，但皮損中染色較弱（表3）。皮損中陽性著色主要見角質(zhì)層，部分病例在棘層可見胞核、胞質(zhì)均著色，基底層偶見陽性。皮損周圍及健康對照皮膚中陽性著色見于表皮全層，胞核、胞質(zhì)均呈深棕色。所有標本可見小汗腺導管細胞部分胞核著色，部分標本可見毛囊內(nèi)根鞘細胞核及皮脂腺腺泡細胞胞質(zhì)陽性染色。

討 論

圖2 脂肪酸結(jié)合蛋白5免疫組化染色（×200） 2A：對稱性肢端角化病皮損中角質(zhì)層、顆粒層及棘層均有強陽性表達；2B：皮損周圍皮膚中顆粒層及棘層弱陽性染色；2C：健康對照皮膚僅棘層下部弱陽性染色

表2 脂肪酸結(jié)合蛋白5在對稱性肢端角化病（SAK）皮損及皮損周圍皮膚和健康對照皮膚表皮各層染色情況

圖3 二氫硫辛酰胺脫氫酶（DLD）免疫組化染色（×200） 3A：對稱性肢端角化病皮損中角質(zhì)層及部分棘層細胞陽性表達；3B：皮損周圍皮膚中表皮全層均有陽性染色；3C：健康對照皮膚表皮全層均有陽性染色

表3 二氫硫辛酰胺脫氫酶在對稱性肢端角化病（SAK）皮損及皮損周圍皮膚和健康對照皮膚表皮各層染色情況

本文結(jié)果顯示，SAK皮損、皮損周圍皮膚及健康對照皮膚中FABP5 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義，但免疫組化顯示，皮損中FABP5蛋白表達明顯上調(diào)。FABP5在正常皮膚中表達較低，只表達在分裂后角質(zhì)形成細胞（KC），而基底細胞和暫時擴增細胞幾乎不表達。有研究顯示，銀屑病皮損中FABP5表達增多，主要位于棘層［9-10］。重組FABP5轉(zhuǎn)染健康人KC誘導角蛋白K10和外皮蛋白高表達，而RNA干擾抑制FABP5的NF-κB和JNK信號通路，下調(diào)K10和外皮蛋白表達［9］。在銀屑病皮損KC培養(yǎng)過程中，抑制FABP5使細胞分化明顯減少；在高鈣（1.8 mmol/L氯化鈣）條件下，F(xiàn)ABP5沉默下調(diào)K10和外皮蛋白表達，而生存素和K16表達幾乎完全消失［9］。這些結(jié)果表明，F(xiàn)ABP5在KC分化中有重要作用，可能是導致銀屑病皮損中KC異常分化的原因之一［9］。我們前期的免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，SAK皮損中K16、外皮蛋白表達明顯上調(diào)，而K10表達與正常皮膚相似。SAK皮損中FABP5、K16、外皮蛋白表達模式類似于銀屑病，提示FABP5可能通過調(diào)節(jié)K16、外皮蛋白表達參與KC異常分化過程。此外，F(xiàn)ABP5參與輔助T細胞、神經(jīng)細胞等多種細胞的分化過程，在一些免疫相關(guān)細胞（如肺泡內(nèi)巨噬細胞、胸腺皮質(zhì)細胞、脾樹突細胞、肥大細胞）中也有表達［9，14］。本研究發(fā)現(xiàn)，SAK 皮損、皮損周圍皮膚及健康對照皮膚中真皮淺層均有少量浸潤細胞表達FABP5，提示免疫細胞中FABP5表達可能在本病發(fā)生中無明顯作用。

DLD是線粒體多酶復合物的共同黃素蛋白組分，參與體內(nèi)多種代謝途徑，維持能量代謝平衡［12］。在生理條件下，DLD的主要功能是維持能量代謝平衡；在病理條件下，如不穩(wěn)定二聚體突變或者酸性線粒體基質(zhì)環(huán)境下，DLD的兼職硫辛酰胺脫氫酶活性增加，導致能量代謝減少，氧化性損害增加［12］。體內(nèi)氧自由基增多引起線粒體DNA突變、呼吸鏈損傷、線粒體膜損傷、線粒體鈣穩(wěn)態(tài)破壞，促進細胞凋亡及機體老化［14］。皮膚中DLD表達及其生物學作用迄今未見報道，本研究檢測了SAK皮損及健康人皮膚中DLD表達情況。RT-PCR發(fā)現(xiàn)DLD mRNA在SAK皮損、皮損周圍皮膚及健康對照皮膚中表達差異無顯著性；免疫組化顯示，健康表皮全層均有DLD陽性染色，而SAK皮損中DLD表達減少，僅在角質(zhì)層和少數(shù)病例棘層表達。鑒于DLD的主要作用是維持能量代謝平衡，DLD表達下調(diào)提示SAK皮損中存在能量代謝失衡。

由于在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中存在RNA降解和修飾、轉(zhuǎn)錄及翻譯后調(diào)節(jié)，故mRNA與蛋白質(zhì)表達結(jié)果可能不一致［15］。本文的免疫組化染色支持前期的蛋白組學結(jié)果，但SAK皮損中FABP5和DLD mRNA表達未見明顯變化。SAK皮損中FABP5高表達可能參與KC異常分化過程，其具體通路有待繼續(xù)研究；SAK皮損中DLD表達下調(diào)，提示存在能量代謝失衡，角質(zhì)形成細胞中線粒體基質(zhì)環(huán)境、能量代謝及硫辛酰胺脫氫酶活性變化及其在本病發(fā)生中的作用有待進一步研究。

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Expressions of fatty acid binding-protein 5 and dihydrolipoamide dehydrogenase in skin lesions of symmetrical acrokeratoderma

Yang Peipei,Peng Jing,Yu Zuozhong,Shi Ge,Li Zhaojun,Zhang Guoxue,Fan Yiming*.*Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang 524001,Guangdong,China

ObjectiveTo investigate the expressions of fatty acid-binding protein 5 （FABP5）and dihydrolipoamide dehydrogenase（DLD）in skin lesions of symmetrical acrokeratoderma（SAK）,and to explore their significance.MethodsBiopsy specimens were obtained from skin lesions on the wrists and perilesional skin of 9 patients with SAK,and from normal skin in the wrists of 9 healthy volunteers（control group）.Reverse transcription PCR （RT-PCR）and immunohistochemical staining were performed to measure the expressions of FABP5 and DLD in these specimens.ResultsRT-PCR showed no significant differences in the mRNA expressions of FABP5 or DLD between lesional,perilesional and normal control skin specimens（bothP＞ 0.05）.Immunohistochemically,there was a significant increase in the extent and intensity of staining for FABP5 in SAK lesions.Concretely speaking,FABP5 was strongly expressed in the stratum corneum,granular and spinous layers in SAK lesions,but weakly expressed in the stratum corneum,granular and spinous layers in perilesional skin,and only in spinous and basal layers in normal control skin.The expression of DLD decreased in SAK lesions,and was observed only in the stratum corneum and spinous layer in a few cases of SAK.However,the full-thickness epidermis stained positive for DLD in perilesional skin,with the nuclei and cytoplasm both stained deep brown.ConclusionThe overexpression of FABP5 in SAK lesions may participate in dysdifferentiation of keratinocytes,while the down-regulation of DLD expression suggests an imbalance in energy metabolism.

Keratosis;Fatty acid-binding proteins;Dihydrolipoamide dehydrogenase;Symmetrical acrokeratoderma

Fan Yiming,Email:ymfan1963@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.12.004

廣東醫(yī)學院科技創(chuàng)新基金（STIF201103）

樊翌明，Email：ymfan1963@163.com

2015-05-27）

（本文編輯：顏艷）