劉文雅， 郝瑤瑤， 胡慧陽， 陳維聰， 戴 箭*

（中山大學 工學院，廣東 廣州 510006）

近幾十年來，腫瘤化療發(fā)展成為癌癥治療的主要途徑之一，但多數(shù)抗癌藥物（如紫杉醇）的水溶性較差，而能溶于水的抗癌藥物（如質(zhì)子化阿霉素等）也普遍存在血液半衰期過短、對健康組織及細胞毒副作用大等問題[1-2]。因此，發(fā)展用于抗癌藥物高效傳輸?shù)乃幬镙d體具有重要的意義[3-4]。

本文以可生物降解的親水性天然葡聚糖為反應(yīng)底物，通過縮醛化反應(yīng)制備兩親性的縮醛化葡聚糖，再利用乳化法制備出載藥縮醛化葡聚糖納米粒子。核磁共振、傅里葉紅外等理化表征手段表征了縮醛化葡聚糖，研究了其在酸性條件下水解釋放運載的藥物的性能。本文以期解決化療藥物溶解性低的問題，利用腫瘤細胞內(nèi)獨特的微酸環(huán)境釋放藥物[5]，作為藥物載體具有其獨特的優(yōu)勢。

1 實驗

1.1 原料與儀器

葡聚糖（分子量5000道爾頓，純度98%，阿拉?。?，將一定量的葡聚糖溶解在純水中，并在－86℃冰箱中冷凍12 h后，放置到冷凍干燥機中凍干除水。凍干后的葡聚糖呈白色棉絮狀，備用。2-甲氧基丙烯購置于西格瑪奧德里奇（Sigma Aldrich，進口藥品，分析純）；吡啶對甲苯磺酸（分析純）購置于阿法埃薩（天津）化學有限公司。二甲基亞砜、三乙胺、氯仿，均購置于廣州市化學試劑廠。NMR溶劑：重水（D2O）、氘代DMSO（DMSO-d6）、氘代氯仿（CDCl3）、氘代鹽酸，均購買于阿達瑪斯。所用純水為實驗室配置的Millopore公司Milli-Q Century超純水體系Millipak-40（MPGl 04S K2）設(shè)備純化制得。

核磁共振光譜儀（400 MHz, Avance Ⅲ, Bruker），納米粒度儀及Zeta電位分析儀（Zetasizer Nano ZS90,Malvern），冷凍干燥機（4.5 L Freeze Dry System, Labconco），高速離心機（Sorvall Stratos, Thermo），手套箱（Mbraun MB-Labstar, 德國），傅里葉變換紅外光譜儀（VERTEX 70, Bruker Optik GMBH），恒溫磁力加熱攪拌器（IKA RCT basic），電子天平（BSA 224S-CW），超聲波細胞破碎儀（S-4000, 美國sonicator）。

1.2 縮醛化葡聚糖的合成

對反應(yīng)瓶進行無水無氧處理，而后將0.5 g的葡聚糖溶于10 mL的DMSO溶液中，在氮氣保護下依次加入吡啶對甲苯磺酸0.042 g，0.055 eq（“eq”為相對于葡聚糖結(jié)構(gòu)單元摩爾數(shù)的比例，下同）和2-甲氧基丙烯（1.765 mL，6.2 eq），室溫下攪拌反應(yīng)一段時間，加入三乙胺終止反應(yīng)，所的產(chǎn)物沉于pH＝8.0的純水中并靜置一段時間，而后離心，渦旋，收集沉淀凍干即得產(chǎn)物，通過核磁計算分子量及反應(yīng)程度[6-7]。

1.3 理化表征

核磁共振氫譜（1H-NMR）：取4～5 mg樣品，溶于0.55 mL的氘代試劑中，裝入核磁管，用Bruker AvanceⅢ（400 Hz）核磁共振波譜儀測定，MestReNova軟件處理數(shù)據(jù)。

傅里葉轉(zhuǎn)變紅外光譜（FT-IR）：采用KBr壓片的方法進行表征，用Origin8.0處理數(shù)據(jù)。

聚合物納米載體負載疏水性藥物的制備：將縮醛化葡聚糖（10 mg）和鹽酸阿霉素（1 mg）分別用0.3 mL的二氯甲烷和0.2 mL的氯仿溶解，而后向鹽酸阿霉素的氯仿溶液中加入4 mL的三乙胺調(diào)節(jié)成疏水性阿霉素，將兩者混合均勻。而后將混合體系在探頭超聲條件下逐滴加入至4 mL磷酸鹽緩沖溶液PBS（聚乙烯醇PVA，3% w/w）中，形成油/水（O/W）復合體系。轉(zhuǎn)速10 000 r/min，離心15min，得到紫紅色沉淀，用PBS溶液離心洗滌兩次，除去過量的阿霉素，最后收集得到載藥納米粒子，將其溶于PBS溶液中，備用。

縮醛化葡聚糖的水解實驗：稱取20 mg的縮醛化葡聚糖，用1 mL的DMSO溶解，而后等體積分別緩慢滴加到pH＝5.0的醋酸緩沖溶液和pH＝7.4的PBS中，水浴超聲2 min，放于室溫下攪拌觀察，拍照，記錄反應(yīng)現(xiàn)象。

粒徑測定：樣品縮醛化葡聚糖納米粒子的粒徑通過Malvirn電位粒度儀檢測，取三次測量值作為最終結(jié)果。

縮醛化葡聚糖納米粒子酸敏性釋藥行為的測定：取制備的載藥納米粒子PBS溶液（pH＝7.4），用熒光分光光度計檢測載藥納米粒子中熒光藥物阿霉素，將該測試溶液用0.01 mol/L的稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)成pH＝5.0，在酸性條件下用熒光分光光度計測定，10 min再次測定。

2 結(jié)果與討論

本文引入一種酸敏感連接段―縮醛化結(jié)構(gòu)作為功能基團，可對酸性環(huán)境作出響應(yīng)。通過天然高分子葡聚糖的羥基與二甲氧基丙烯發(fā)生反應(yīng)，形成縮醛化結(jié)構(gòu)，其在堿性條件下穩(wěn)定，在酸性條件下會水解成親水段。縮醛化葡聚糖材料中縮醛結(jié)構(gòu)為聚合物的疏水段，可用于包載疏水性藥物，提高藥物的生物利用度，此疏水段在酸性條件下迅速由疏水性變?yōu)橛H水性，達到藥物酸敏控釋的效果。

2.1 酸敏感改性葡聚糖的制備和表征

縮醛化葡聚糖的合成路徑如圖1所示，用2-甲氧基丙烯作為縮醛化試劑，在吡啶對甲苯磺酸鹽的催化作用下，對端炔基葡聚糖上的羥基進行縮醛化反應(yīng)。將水溶性的葡聚糖轉(zhuǎn)化為pH敏感的疏水性縮醛化葡聚糖。縮醛化反應(yīng)的機理分為兩步：第一步吡啶對甲苯磺酸活化2-甲氧基丙烯上的甲氧基，而后碳正離子與葡聚糖上的羥基發(fā)生親核反應(yīng)生成非成環(huán)結(jié)構(gòu)，第二步吡啶對甲苯磺酸對非成環(huán)結(jié)構(gòu)再次活化，形成穩(wěn)定的五元環(huán)結(jié)構(gòu)。所以在縮醛化反應(yīng)的開始階段大部分都為非成環(huán)結(jié)構(gòu)，隨著反應(yīng)時間的延長，則會形成穩(wěn)定的五元環(huán)結(jié)構(gòu)如圖1所示。由于五元環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及酸性水解機理，成環(huán)與非成環(huán)的醛基在酸性條件下水解存在差異，非成環(huán)部分水解比較快且形成等量的丙酮與甲醇，而成環(huán)部分水解較慢只有丙酮生成?？s醛化反應(yīng)會破壞葡聚糖的羥基質(zhì)子，但對葡聚糖上的C1并無影響，以核磁中葡聚糖上1號位的氫d ＝4.63 ppm為基準，通過積分面積計算可得到縮醛化反應(yīng)的實際取代度。

圖1 縮醛化葡聚糖（AC-DEX）的合成示意圖

葡聚糖和縮醛化葡聚糖在DMSO-d6中的核磁共振氫譜如圖2所示。相比于反應(yīng)物葡聚糖而言，縮醛化葡聚糖的1H-NMR譜圖中d＝1.26 ppm出現(xiàn)的氫譜峰證明了產(chǎn)物中甲氧基官能團的存在及縮醛化反應(yīng)的發(fā)生。在此同時縮醛化葡聚糖上剩余羥基的活潑質(zhì)子氫相對于葡聚糖發(fā)生漂移，由d＝4.79 ppm 和d ＝4.68 ppm漂移至d＝5.4 ppm和d＝5.06 ppm處，這可能由于縮醛化葡聚糖的羥基與甲氧基之間形成了氫鍵，當氫鍵形成時，氫變的更加趨于正電性。供電子基團較多的存在，供電子基團所形成的靜電場將氫拉近，而將羥基氫上的電子推向氧，造成H周圍的電子云密度降低，因而去屏蔽效應(yīng)增加，質(zhì)子的化學位移移向低場。

圖2 縮醛化葡聚糖與葡聚糖在DMSO-d6中的1H-NMR譜圖

圖3 縮醛化葡聚糖和葡聚糖的紅外譜圖

按上述方法制備不同反應(yīng)時間的縮醛化葡聚糖，稱取1 mg與溴化鉀研磨成粉末，壓片，進行紅外光譜分析。葡聚糖和縮醛化葡聚糖的傅里葉紅外光譜圖如圖3所示，在縮醛化葡聚糖的紅外譜圖中，2992 cm-1與1378 cm-1的甲基峰，846 cm-1處異丙基的C-C伸縮振動吸收峰，有力地證明了葡聚糖已成功的發(fā)生了縮醛化反應(yīng)。

2.2 縮醛化葡聚糖的水解

挑選縮醛化反應(yīng)時間為1 h的縮醛化葡聚糖，從而用氘代鹽酸和重水的混合物對縮醛化葡聚糖進行水解實驗的探索。從最終的水解譜圖4中看到縮醛化葡聚糖水解形成葡聚糖，丙酮和甲醇三種物質(zhì)?；瘜W位移d＝3.09 ppm和d＝1.88 ppm分別表示甲醇和丙酮中甲基的氫譜峰，d＝3.16～3.65 ppm為葡聚糖環(huán)和C6上的氫譜峰，而d＝4.63 ppm為葡聚糖上1號位的氫。以1號位的氫為基點，利用成環(huán)與非成環(huán)水解機理，通過計算相應(yīng)的積分面積，可以求出反應(yīng)1 h得到成環(huán)與非成環(huán)比例為3.46，同時計算出縮醛化反應(yīng)程度為 80%，縮醛化葡聚糖的分子量為7 341 g/mol。

圖4 縮醛化葡聚糖在重水（含5%氘代鹽酸）中的1H-NMR譜圖

2.3 縮醛化葡聚糖規(guī)律的探索

2.3.1 縮醛化葡聚糖中發(fā)生反應(yīng)的羥基與反應(yīng)時間的關(guān)系

如圖1所示，縮醛化葡聚糖分子中，一摩爾成環(huán)的縮醛結(jié)構(gòu)可水解成一摩爾丙酮；同時一摩爾非成環(huán)的縮醛結(jié)構(gòu)則水解成一摩爾丙酮和一摩爾甲醇[6]。根據(jù)1H-NMR 分析結(jié)果，計算丙酮和甲醇的含量，則可以分別計算出成環(huán)結(jié)構(gòu)、非成環(huán)結(jié)構(gòu)的比例，根據(jù)葡聚糖分子（分子量5 000道爾頓）有30.8個重復單元，92.4個羥基，計算參與反應(yīng)的羥基數(shù)目與百分數(shù)，繪制其與反應(yīng)時間的關(guān)系圖，如圖5所示。由圖5可以得出，縮醛反應(yīng)快速發(fā)生并在0.5 h內(nèi)達到97%?？s醛化反應(yīng)為可逆反應(yīng)，隨著反應(yīng)時間的增加，反應(yīng)程度逐漸降低并逐漸保持不變。

圖5 葡聚糖發(fā)生縮醛化反應(yīng)的羥基轉(zhuǎn)化率與反應(yīng)時間的關(guān)系圖

圖6 不同反應(yīng)時間下葡聚糖發(fā)生成環(huán) 和非成環(huán)結(jié)構(gòu)的羥基的比例

2.3.2 縮醛化葡聚糖中發(fā)生成環(huán)與非成環(huán)的羥基數(shù)目與反應(yīng)時間的關(guān)系

根據(jù)1H-NMR 分析結(jié)果，計算出發(fā)生成環(huán)、非成環(huán)反應(yīng)的羥基數(shù)目，繪制其與反應(yīng)時間的關(guān)系圖，如圖6所示。由圖6可以看出，反應(yīng)時間1 h以內(nèi)，縮醛中非成環(huán)結(jié)構(gòu)占主要部分，成環(huán)結(jié)構(gòu)較少，1 h之后，成環(huán)結(jié)構(gòu)的比例逐漸上升直至24 h，有66%的羥基發(fā)生成環(huán)的縮醛反應(yīng)。

2.4 載藥納米粒子的粒徑測定

將制備好的載藥縮醛化葡聚糖納米粒子溶液，用馬爾文電位粒度儀檢測其粒徑分布，取三次測量值的平均值作為最終結(jié)果，所得載藥納米粒子的粒徑為501.9±15.8 nm，其測試結(jié)果如圖7所示，從動態(tài)光散射柱狀圖可以看出聚合物載藥納米粒子的粒徑分布集中在500 nm左右，分布指數(shù)PDI為0.243。

圖7 載藥納米粒子的動態(tài)光散射柱狀圖

圖8 載藥納米粒子在不同pH條件下的熒光譜圖

2.5 縮醛化葡聚糖納米粒子酸敏性釋藥行為的測定

取制備的載藥縮醛化葡聚糖納米粒子PBS溶液（pH＝7.4），用熒光分光光度計檢測載藥納米粒子中熒光藥物阿霉素。將該測試溶液用0.01 mol/L的稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)成pH＝5.0，在酸性條件下用熒光分光光度計測定，10 min再次測定，其測試結(jié)果如圖8所示。由圖8中得出，在pH＝7.4時，熒光強度為90萬左右，pH＝5.0的條件下，熒光強度迅速增強將近3倍，10 min后再次增強為5倍，藥物阿霉素進一步被釋放，說明所設(shè)計的納米載藥系統(tǒng)具有優(yōu)秀的酸敏釋藥能力。上述測試結(jié)果表明酸敏型改性葡聚糖載體材料具有顯著的酸敏感性，其反應(yīng)性酸敏內(nèi)核在酸性條件下可迅速由疏水性變?yōu)橛H水性，快速釋放藥物，可以達到智能控釋的目的。

3 結(jié)論

以可生物降解的親水性天然葡聚糖為反應(yīng)底物，通過縮醛化反應(yīng)制備兩親性的縮醛化葡聚糖。核磁共振、傅里葉紅外等理化表征手段確定縮醛化葡聚糖成功地合成。利用乳化法制備出的載藥縮醛化葡聚糖納米粒子用動態(tài)光散射法測得粒徑為 501.9±15.8 nm。用乳化法制備的載藥納米粒子的釋放具有優(yōu)異的 pH響應(yīng)性。熒光分光光度計檢測載藥納米粒子在pH＝7.4緩沖介質(zhì)中阿霉素熒光藥物的酸敏釋放行為。發(fā)現(xiàn)在pH＝5.0的緩沖介質(zhì)中釋放10 min之后，熒光強度較pH 7.4中增強5倍，說明所設(shè)計的納米載藥系統(tǒng)具有的酸敏釋藥功能。

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