賈二坷 馮亞寧 李江偉

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院　新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊　830046）

抗CD47胞外區(qū)駱駝多克隆抗體的制備及鑒定

賈二坷 馮亞寧 李江偉

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830046）

驗(yàn)證人CD47蛋白能否在新疆雙峰駝中產(chǎn)生高滴度抗體；為制備高親和力的抗CD47納米抗體提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 構(gòu)建CD47胞外區(qū)原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)及純化CD47蛋白，免疫新疆雙峰駝。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和Western blot分別檢測駱駝多克隆抗體的效價(jià)及與CD47蛋白特異性結(jié)合活性。結(jié)果顯示，成功構(gòu)建CD47胞外區(qū)原核表達(dá)載體，獲得純度大于90%的CD47蛋白，表達(dá)純化的CD47重組蛋白可與抗CD47單抗B6H12.2特異結(jié)合；ELISA測定CD47重組蛋白免疫駱駝7次后，抗CD47多克隆抗血清的效價(jià)至少達(dá)到1∶200 000，免疫印跡檢測表明抗CD47駱駝抗血清與CD47重組蛋白、Jurkat和Raji細(xì)胞表面表達(dá)的CD47均能特異結(jié)合。 重組人CD47蛋白可以在駱駝體內(nèi)激發(fā)高滴度抗體反應(yīng)。

CD47；多克隆抗體；新疆雙峰駝；納米抗體

腫瘤免疫逃逸是阻礙抗腫瘤免疫治療的一大障礙，巨噬細(xì)胞通過其表面表達(dá)的Fc受體對包括腫瘤在內(nèi)的靶細(xì)胞行使吞噬作用，是抗體發(fā)揮細(xì)胞毒作用（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）的主要效應(yīng)細(xì)胞。在抗腫瘤免疫反應(yīng)中，巨噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬作用涉及巨噬細(xì)胞識別靶細(xì)胞表面的促吞噬（“eat me”）和抗吞噬（“don’t eat me”）信號［1］。巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞表面表達(dá)信號調(diào)節(jié)蛋白α（Signal regulatory protein alpha，SIRPα），與一種廣泛表達(dá)的跨膜蛋白CD47結(jié)合［2］，使得巨噬細(xì)胞啟動抗吞噬信號，從而避免了對正常細(xì)胞的攻擊。

CD47又叫整合素相關(guān)蛋白（integrin associated protein，IAP），是一個(gè)50 kD的膜表面蛋白，表達(dá)廣泛，屬于免疫球蛋白超家族成員，具有IgV樣胞外結(jié)構(gòu)域和5個(gè)跨膜區(qū)以及1個(gè)短的胞質(zhì)尾［2］。CD47可以結(jié)合整合素和凝血栓蛋白-1（thrombospondin-1，TSP-1），參與多種生理和病理過程，包括細(xì)胞遷移［3］，T細(xì)胞和DC的激活［4］以及軸突發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖和炎癥等。最近一系列研究報(bào)道抗CD47單克隆抗體可以阻斷CD47-SIRPα信號通路，激活巨噬細(xì)胞的吞噬作用，在白血病和淋巴瘤以及腫瘤和實(shí)體瘤腫瘤動物模型中，都取得了良好的治療效果［5-10］，表明CD47可以作為腫瘤治療的理想靶點(diǎn)。

目前抗CD47的抗體研究主要集中在單克隆抗體。然而，大分子的單克隆抗體具有組織（如實(shí)體瘤）的穿透能力差、且難以結(jié)合位于細(xì)胞表面的蛋白裂隙中的表位（如受體和配體結(jié)合部位）的缺點(diǎn)。另外還有生產(chǎn)和儲存成本高、價(jià)格昂貴等因素限制了這類藥物在臨床的廣泛使用。

納米抗體是1993年發(fā)現(xiàn)的一種僅存在于駱駝科動物中的天然重鏈抗體的可變區(qū)結(jié)構(gòu)（variable domains of the HCAb，簡稱為VHH）［11］，其分子量為15 kD，僅為全分子抗體的1/10，分子大小在納米級，是目前可以得到的具有完整抗體功能的最小分子片段。這種納米抗體的抗原結(jié)合區(qū)具有與常規(guī)單抗不同的結(jié)構(gòu)［12］，在空間上呈突出的指狀結(jié)構(gòu)，因此可以結(jié)合一些常規(guī)抗體無法接近的抗原表位，如位于受體裂隙中的配體結(jié)合部位［13］。這使得這類抗體具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

本研究為驗(yàn)證CD47重組蛋白能否在駱駝中激發(fā)高滴度的特異抗體，從而為構(gòu)建駱駝淋巴細(xì)胞重鏈抗體基因表達(dá)文庫提供材料，我們采用原核表達(dá)的人CD47胞外區(qū)片段作為抗原免疫駱駝，并檢測駱駝免疫CD47后的體液免疫水平，以及駱駝多克隆抗體與Jurkat、Raji（均高表達(dá)CD47蛋白［7，14］）細(xì)胞表面表達(dá)的CD47蛋白的特異結(jié)合，為今后制備抗CD47的納米抗體，進(jìn)而研究其抗腫瘤作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 CD47的cDNA購自Sino Biologicai Inc；DH5α感受態(tài)細(xì)胞，BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司。雄性新疆雙峰駝一頭，1年齡，本地區(qū)飼養(yǎng)。Raji細(xì)胞購自長沙贏潤生物技術(shù)有限公司，Jurkat細(xì)胞由暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院饋贈。

1.1.2 試劑 Ex Taq polymerse，限制性內(nèi)切酶Bam H Ⅰ、Eco RⅠ，T4 ligation 購自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Ni SepharoseTM6 Fast Flow購自GE Healthcare公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Life Science公司，Bradford法蛋白定量試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；Mouse anti-CD47 IgG（B6H12）購自BD公司（中國）；Rabbit anti-Llama IgG（H&L），Affinity Pure購自ImmunoReagents，Inc；抗His標(biāo)簽鼠源單克隆抗體，山羊抗鼠IgG（H&L）-HRP，山羊抗兔IgG（H&L）-HRP購自康為世紀(jì)；完全弗式佐劑及不完全弗式佐劑購自Sigma（中國）；細(xì)胞膜抽提試劑盒購自碧云天公司；BeyoECL顯色液購自Beyotime公司；其他常規(guī)試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 CD47胞外區(qū)的擴(kuò)增 將含有CD47的cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過培養(yǎng)細(xì)菌，提取質(zhì)粒，作為PCR擴(kuò)增CD47胞外區(qū)基因序列擴(kuò)增的模板。根據(jù)CD47胞外區(qū)堿基序列設(shè)計(jì)引物：P1：5'-CCGGATCCCAGCTACTATTTAATAAAAC-3'（下劃線為含有Bam HⅠ酶切位點(diǎn)）；P2：5'-CCCT CGAGGATTTTATAGCACAACAAAGT-3'，（下劃線為Eco RⅠ酶切位點(diǎn)）。PCR反應(yīng)體系：ddH2O 13.5 μL，dNTP 2 μL，10×Ex Taq buffer 2 μL，P1 0.3 μL，P2、0.3 μL，TaKaRa Ex Taq 0.3 μL，質(zhì)粒：1 μL，共20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 35 s，61℃ 35 s，72℃ 35 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化。

1.2.2 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 回收純化的目的片段用 Bam HⅠ和Eco RⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切。同時(shí)活化DH5α-pET30a菌種，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，用同樣的限制性內(nèi)切酶酶切pET30a?；厥彰盖械哪康钠魏洼d體經(jīng)T4連接酶16℃過夜連接。最后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取轉(zhuǎn)化的陽性克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切和基因測序鑒定，重組質(zhì)粒命名為 DH5α-pET30a-CD47。

1.2.3 CD47蛋白的原核表達(dá)純化及鑒定 將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)過夜；次日扎取單克隆，菌液PCR鑒定，按1%接菌到10 mL含有終濃度為50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，220 r/min震蕩4 h；加IPTG使終濃度為1 mmol/L誘導(dǎo)4 h，取樣經(jīng)SDS-PAGE檢測蛋白的表達(dá)。同時(shí)用Western blot檢測誘導(dǎo)所得蛋白：一抗分別為抗His標(biāo)簽鼠源單克隆抗體，Mouse anti-CD47 IgG，稀釋比例均為1∶2 000；二抗為山羊抗鼠IgG（H&L）-HRP；稀釋比例為1∶5 000，ECL顯色，Las4000檢測。大量培養(yǎng)和誘導(dǎo)BL21-pET30a-CD47，用鎳親和層析柱純化。

1.2.4 CD47蛋白免疫新疆雙峰駝 純化的CD47蛋白經(jīng)Bradford法測定濃度約為0.9 mg/mL。用純化的蛋白免疫新疆雙峰駝：每次免疫的量為0.44 mg，第一次免疫使用等體積的完全弗式佐劑，之后的6次加強(qiáng)免疫時(shí)加等量的不完全弗式佐劑，每14 d免疫1次，共免疫7次，采集免疫前和免疫后的駱駝血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 ELISA檢測多克隆抗體的效價(jià) rCD47蛋白在96孔板中4℃包被過夜。對免疫前、后的駱駝血清，進(jìn)行倍比稀釋，作為一抗測定駱駝血清抗CD47蛋白的血清效價(jià)。二抗為兔抗美洲駝IgG（H&L），稀釋比例為1∶3 000；采用HRP-羊抗兔IgG（H& L）作為檢測抗體（稀釋比例為1∶5 000）。底物為TMB，采用ECL檢測，酶標(biāo)儀中測定540 nm吸光值。

1.2.6 Western blot檢測多克隆抗體與細(xì)胞表面表達(dá)CD47的結(jié)合 將Jurkat細(xì)胞接種于含10% FBS的1640培養(yǎng)基中，37℃，5.0% CO2培養(yǎng)。收集3×107個(gè)Jurkat細(xì)胞，利用細(xì)胞膜提取試劑盒抽提Jurkat細(xì)胞膜蛋白。用分離膠濃度為12%的SDS-PAGE分離蛋白，使用PVDF膜轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為90 V，1 h。駱駝源多克隆抗體、Mouse anti-CD47 IgG（B6H12.2）為 一 抗；Rabbit anti-Llama IgG（H&L）、 山 羊 抗鼠IgG（H&L）-HRP分別為二抗；山羊抗兔IgG（H&L）-HRP為三抗。ECL顯色，Las4000檢測。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增CD47胞外區(qū)基因片段

將pGEM-CD47質(zhì)粒作為模板，用CD47特異引物擴(kuò)增該基因片段。CD47胞外區(qū)片段大小為363 bp（圖1）。

圖1 PCR擴(kuò)增CD47胞外區(qū)基因片段

2.2 重組質(zhì)粒pET30a-CD47的構(gòu)建與鑒定

用限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和Eco RⅠ對重組質(zhì)粒pET30a-CD47進(jìn)行雙酶切，出現(xiàn)一條線性載體條帶和一條363 bp的目的條帶（圖2），將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒測序，結(jié)果表明插入的目的基因核苷酸序列完全正確。

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切分析

2.3 CD47的原核表達(dá)及融合蛋白的純化

將陽性克隆的重組子小量擴(kuò)增后，用1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，得到22 kD的重組蛋白（圖3），蛋白大小符合預(yù)期分子量。且經(jīng)Western blotting檢測（圖4-B），鑒定所得蛋白為CD47。進(jìn)一步大量誘導(dǎo)菌體，經(jīng)超聲破碎后，檢測到重組蛋白以包涵體形式表達(dá)。沉淀用含4 mol/L尿素的Tris-HCl溶解，通過鎳親和層析之后，重組蛋白純度可達(dá)90%以上。

圖3 SDS-PAGE檢測CD47蛋白表達(dá)

2.4 CD47蛋白的鑒定

通過Western blotting檢測重組蛋白CD47。結(jié)果（圖4-A）顯示，純化的CD47蛋白與抗His標(biāo)簽的單克隆抗體特異結(jié)合。經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h的菌體總蛋和純化的CD47蛋白均可與Mouse anti-CD47 IgG結(jié)合（圖4-B），而不與未誘導(dǎo)的菌體總蛋白結(jié)合。

圖4 Western blotting檢測CD47蛋白

2.5 抗體效價(jià)的測定

利用重組蛋白免疫新疆雙峰駝，獲得了抗CD47的駱駝源多克隆抗體。取免疫前的血清和最后一次加強(qiáng)免疫后第4天收集的血清，通過ELISA測定抗體的效價(jià)。抗原CD47蛋白的包被量為5 μg/孔；駱駝來源的血清按1×103、2×103、1×104、2×104、1×105和2×105梯度稀釋。結(jié)果（圖5）表明駱駝來源的抗體效價(jià)至少為1∶200 000。

圖5 ELISA測定駱駝來源抗CD47抗體的效價(jià)

2.6 Western blotting鑒定駱駝多克隆抗體與CD47

的結(jié)合

Western blotting結(jié)果（圖6）表明，與抗CD47單抗B6H12.2一樣，駱駝多克隆抗體既能與重組的CD47蛋白結(jié)合，也能與Jurka、Raji細(xì)胞表面CD47蛋白特異性結(jié)合。而未免疫的血清（圖6-A泳道1，6-B泳道3和4）與重組CD47和細(xì)胞表面表達(dá)的CD47均不結(jié)合。

圖6 Western blotting檢測駱駝多抗與rCD47（A）和細(xì)胞表面CD47蛋白（B）的結(jié)合

3 討論

新疆雙峰駝屬于駱駝科駱駝屬，該屬目前僅存兩種。除廣泛分布于我國新疆、青海、內(nèi)蒙等地以及蒙古的雙峰駝外，還有分部于中亞地區(qū)和非洲北部的單峰駝。由于新疆雙峰駝飼養(yǎng)方式多為放養(yǎng)，給免疫操作帶來了困難。另外，根據(jù)我們和國外研究者的經(jīng)驗(yàn)，并不是所有抗原都能在駱駝中激發(fā)高滴度抗體反應(yīng)。Daley［15］發(fā)現(xiàn)，感染Parelaphostrongylus tenuis寄生蟲的美洲駝不能產(chǎn)生保護(hù)性的抗體反應(yīng)。為了獲得高水平的抗CD47駱駝IgG，尤其是重鏈亞型的抗體，有必要分析其體液免疫水平。本研究采用重組CD47胞外區(qū)蛋白，經(jīng)過對駱駝7次免疫后，在駱駝外周血中檢測到了高滴度的抗CD47 IgG抗體（1∶200 000），表明免疫策略是成功的，重組表達(dá)的CD47抗原在駱駝中具有較強(qiáng)的免疫源性。

CD47為5次跨膜蛋白，其氨基端116個(gè)氨基酸為胞外Ig樣結(jié)構(gòu)域，是結(jié)合SIRPα的主要區(qū)域［16］，該區(qū)域也是抗體結(jié)合的主要位點(diǎn)。因此，本研究克隆和表達(dá)了這部分序列，作為免疫用抗原。但在最初大腸桿菌中表達(dá)人CD47胞外區(qū)蛋白時(shí)，表達(dá)量極低甚至不表達(dá)?？紤]到大腸桿菌密碼子的偏好性，我們對CD47的密碼子進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的CD47基因在大腸肝菌中獲得了較高水平的表達(dá)，滿足了免疫駱駝的要求。另外，盡管駱駝屬于體型高大的動物，但國外報(bào)道用于免疫的抗原的劑量最少可低至50 μg/次［17］。本實(shí)驗(yàn)采用抗原劑量為0.44 mg/次，皮下單點(diǎn)或多點(diǎn)注射，激發(fā)了較高的抗體反應(yīng)。今后在免疫駱駝時(shí)還可以對免疫用抗原劑量進(jìn)行優(yōu)化，以最大限度減少抗原的用量，并獲得高水平的抗體反應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究采用原核表達(dá)，并經(jīng)過密碼子優(yōu)化后的人CD47胞外區(qū)抗原可以在駱駝體內(nèi)誘導(dǎo)高滴度的抗體反應(yīng)，免疫后的新疆雙峰駝血清特異性結(jié)合CD47蛋白，可用于后續(xù)抗體基因文庫的構(gòu)建。免疫印跡檢測表明抗CD47駱駝抗血清也可與Jurkat和Raji細(xì)胞表面高表達(dá)的CD47特異結(jié)合，表明新疆雙峰駝是獲得重鏈抗體的可靠宿主，也是制備重鏈抗體庫的良好材料。

［1］Chao MP， Weissman IL， Majeti R. The CD47-SIRPα pathway in cancer immune evasion and potential therapeutic implications［J］. Curr Opin Immunol， 2012， 24（2）：225-232.

［2］Brown EJ， Frazier WA. Integrin-associated protein（CD47）and its ligands［J］. Trends Cell Biol， 2001， 11（3）：130-1355.

［3］Jaiswal S， Jamieson CH， Pang WW， et al. CD47 is upregulated on circulating hematopoietic stem cells and leukemia cells to avoid phagocytosis［J］. Cell， 2009， 138：271-285.

［4］Sarfati M， Fortin G， Raymond M， et al. CD47 in the immune response：Role of thrombospondin and sirp-alpha reverse signaling［J］. Curr Drug Targets， 2008， 9（10）：842-850.

［5］Poels LG， Peters D， van MY， et al. Monoclonal antibody against human ovarian tumor associated antigens［J］. J Natl Cancer Inst，1986， 76：781-791.

［6］Chao MP， Alizadeh AA， Tang C， et al. Therapeutic antibody targeting of CD47 eliminates human acute lymphoblastic leukemia［J］. Cancer Res， 2011， 71：1374-1384.

［7］Chao MP， A lizadeh AA， Tang C， et al. Anti-CD47 antibody synergizes with rituximab to promote phagocytosis and eradicate non-Hodgkin lymphoma［J］. Cell， 2010， 142：699-713.

［8］Rendtlew Danielsen JM， Knudsen LM， Dahl IM， et al. Dysregulation of CD47 and the ligands thrombospondin 1 and 2 in multiple myeloma［J］. Br J Haematol， 2007， 138：756-760.

［9］Chan KS， Espinosa I， Chao MP， et al. Identification， molecular characterization， clinical prognosis， and therapeutic targeting of human bladder tumor-initiating cells［J］. Proc Natl Acad Sci，2009， 106：14016-14021.

［10］ W illingham SB， Volkmer JP， Gentles AJ. The CD47-signal regulatory protein alpha（SIRPa）interaction is a therapeutic target for human solid tumors［J］. Proc Natl Acad Sci， 2012， 109（17）：6662-6667.

［11］Hamers-Casterman C， Atarhouch T， Muyldermans S， et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains［J］. Nature， 1993，363（6428）：446-448.

［12］Serge M. Nanobodies：Natural single-domain antibodies［J］. Annual Review of Biochemistry， 2013， 82：17.1-17.23

［13］De GE， Silence K， Decanniere K， et al. Molecular basis forthe preferential cleft recognition by dromedary heavy- chain antibodies［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2006， 103（12）：4586-4591.

［14］Zhao XW， Taco WK， Timo KB. targeting of CD47-SIRP？ Enough for treating hematopoietic malignancy［J］. BLOOD， 2012， 119：18.

［15］Daley LP， Gagliardo LF， Duffy MS， et al. Application of monoclonal antibodies in functional and comparative investigations of heavychain immunoglobulins in new world camelids［J］. Clin Diagn Lab Immunol， 2005， 12（3）：380-386.

［16］Barclay AN， Van den Berg TK. The interaction between Signal Regulatory Protein Alpha（SIRPα）and CD47 structure， function，and therapeutic target［J］. Annu Rev Immunol， 2013， 32：25-50.

［17］Lauwereys M， Ghahroudi MA， Desmyter A， et al. Potent enzyme inhibitors derived from dromedary heavychain antibodies［J］. EMBO J， 1998， 17：3512-3520.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Preparation and Identification of Polyclonal Antibody Against CD47 Derived from Camel

Jia Erke Feng Yaning Li Jiangwei
（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi830046）

This work aims to verify whether or not recombinant human CD47 would induce high antibody response in Xinjiang Camelus bactrianus， and provide the experimental evidences for preparing anti-CD47 nanobody of high affinity. The gene segment of CD47 extracellular region was amplified by PCR and ligated into pET30a plasmid， and a prokaryotic expression vector was constructed. The recombinant CD47 protein （rCD4） was expressed by IPTG induction and purified with Ni-affinity chromatography. A male C. bactrian camel was immunized with purified rCD47 antigen. The enzyme-linked immunosorbent （ELISA） and Western blotting were applied to assay the titer of polyclonal antibody and the specific binding to CD47 protein. The purified rCD47 of high purity （90%） from prokaryotic expression vector of CD47 extracellular region bound specifically with B6H12.2 of anti-CD47. The ELISA results revealed that the titer of polyclonal anti-CD47 antibody in camel at least reached 1:200000 after the 7th immunization. The Western blotting results demonstrated that camel antiserum of resisting CD47 specifically bound with rCD47， and CD47 on membrane of Jurkat and Raji cells. In conclusion， the anti-CD47 polyclonal antibodies of high titer were raised in camel and it lay a promising foundation for the future experiment.

CCD47；polyclonal antibody；Bactrian camel；nanobody

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.029

2014-11-24

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31370933）

賈二坷，女，碩士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物；E-mail：erkejia@sina.com

李江偉，男，博士，教授，研究方向：分子免疫學(xué)；E-mail：jwli67@sina.com