陳春琳 劉祥 俱雄

（陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，漢中　723001）

重組綠膿桿菌外膜蛋白OprF的表達(dá)、純化及多克隆抗體制備與鑒定

陳春琳 劉祥 俱雄

（陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，漢中723001）

綠膿桿菌外膜蛋白OprF可有效激活機(jī)體的免疫機(jī)制對(duì)抗細(xì)菌的感染，在疫苗上有很好的應(yīng)用前景。采用分子克隆方法獲得綠膿桿菌外膜蛋白OprF表達(dá)菌株；利用SDS-PAGE電泳切膠純化、尿素梯度復(fù)性獲得OprF蛋白，免疫小鼠制備OprF蛋白多克隆抗體。ELISA法表明，OprF抗血清滴度達(dá)1∶12 800倍，Western blotting證實(shí)抗血清具有很好的特異性。通過DNAMAN軟件對(duì)OprF序列同源性分析發(fā)現(xiàn)其C端在不同細(xì)菌間存在較高同源性；采用MEGA軟件對(duì)OprF的系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬細(xì)菌的親緣關(guān)系高于其它屬細(xì)菌。

OprF蛋白；多克隆抗體；酶聯(lián)試驗(yàn)；Western blotting；系統(tǒng)發(fā)生分析

綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa），又名銅綠假單胞菌，自然界分布廣泛，常存在于人與動(dòng)物的皮膚和腸道上，是一種人獸共患病原菌。當(dāng)動(dòng)物體重大疾病創(chuàng)傷、免疫缺陷，以及身體燒傷后，易誘發(fā)該病的感染［1，2］。目前，由于抗生素的大量使用，綠膿桿菌耐藥性不斷提高，對(duì)該菌感染的治療產(chǎn)生一定的影響［3，4］。研究發(fā)現(xiàn)免疫原性較強(qiáng)的綠膿桿菌外膜蛋白有OprF（Outer membrane lipoprotein）、OprI和OprH［5］。其中，OprF為細(xì)胞外膜孔道蛋白，具有兩種不同大小的孔徑結(jié)構(gòu)，在抗生素耐藥性和維持細(xì)胞穩(wěn)定性上起重要作用［6］；可激活機(jī)體特異性免疫反應(yīng)，從而抵抗綠膿桿菌的感染［7，8］，在疫苗上具有很好的應(yīng)用前景［9］。

本實(shí)驗(yàn)利用分子克隆方法獲得綠膿桿菌OprF原核表達(dá)菌株；純化OprF蛋白，制備和鑒定OprF蛋白多克隆抗體；并對(duì)OprF進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，旨在為OprF蛋白功能與疫苗開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 P. aeruginosa PAO1菌株，E.coli DH5α菌株，E. coli BL21菌株，pET-28a質(zhì)粒均由陜西理工學(xué)院生物化學(xué)分子實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明鼠購(gòu)于漢中市動(dòng)物交易中心。

1.1.3 試劑 蛋白胨、IPTG、酵母粉，以及瓊脂糖購(gòu)于西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；Taq酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、Protein Marker，以及DNA Marker均為寶生物公司產(chǎn)品；基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒為西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒為上海生物工程公司；引物合成、基因序列測(cè)定均由西安沃爾森生物技術(shù)有限公司完成；山羊抗小鼠IgG二抗購(gòu)于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)NCBI公布的綠膿桿菌基因序列，設(shè)計(jì)oprF基因引物：Primer 1：5'-ACAGGATCCATGAAACTGAAGAACACC-3'；Primer 2：5'-AGTCTCGAGTTACTTGGCTTCAGCTTC-3'，下劃線分別為限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Bam H I和Xho I。50 μL的PCR反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)緩沖液5 μL，模板DNA 2 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，25 μmol/L引物各1 μL，Taq酶0.5 μL，補(bǔ)水至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸10 min；最后16℃保溫。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR片段大小，膠回收試劑盒回收目的DNA片段。再將PCR產(chǎn)物與pET-28a質(zhì)粒載體利用Bam H I和Xho I雙酶切后，T4 DNA連接酶16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行Bam H I和Xho I雙酶切鑒定及測(cè)序鑒定，檢驗(yàn)正確后轉(zhuǎn)化E. coli BL21表達(dá)菌株，制備OprF原核表達(dá)菌株。

1.2.2 重組蛋白的表達(dá)檢測(cè) 將鑒定正確的OprF表達(dá)菌株單克隆過夜培養(yǎng)，以1∶100倍轉(zhuǎn)接入新鮮的LB培養(yǎng)基中，待OD600≈0.6時(shí)，加入終濃度0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h，離心收集1 mL菌體，加入200 μL上樣緩沖液，沸水中煮樣5 min，上樣10 μL，SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)OprF蛋白表達(dá)情況。

1.2.3 重組蛋白的純化 由于OprF的表達(dá)蛋白主要以包涵體形式存在，因此采用SDS-PAGE蛋白電泳切膠純化OprF比較合適，主要步驟為：大量培養(yǎng)獲得OprF表達(dá)菌株，加入50 mmol/L Tris-HCl（pH7.4）緩沖液超聲破碎，沉淀用洗滌液（含0.05% Triton X-100的Tris-HCl溶液）洗滌后，將包涵體溶解于8 mol/L尿素溶液中；進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，切下目的條帶，研缽中研磨后加入蛋白浸提液（含0.1% SDS的Tris-HCl溶液），4℃浸提過夜，離心收集上清，加入1∶4（V/V）的丙酮沉淀蛋白，離心除去丙酮后加入50 mmol/L Tris-HCl（pH7.4）的蛋白溶解液，最后取適量溶液電泳檢測(cè)蛋白的純度與濃度。

1.2.4 重組蛋白的復(fù)性 SDS-PAGE電泳切膠純化獲得的OprF蛋白無生物學(xué)活性，可采用尿素濃度梯度的方法復(fù)性蛋白，主要步驟為：將純化的OprF蛋白溶解于8 mol/L尿素溶液，置透析袋中，再將其放入含6 mol/L尿素的50 mmol/L Tris-HCl（pH7.4）中，4℃放置4 h；接著依次為4、2、1和0.5 mol/L尿素，最后置于50 mmol/L Tris-HCl（pH7.4）中，4℃放置4 h；然后離心取上清溶液，取2 μL溶液進(jìn)行SDSPAGE蛋白電泳檢測(cè)。

1.2.5 重組蛋白小鼠多克隆抗體的制備 選用約5周齡的雄性昆明鼠6只，每只免疫純化的OprF蛋白50 μg/每次。首次免疫采用弗氏完全佐劑，之后均采用弗氏不完全佐劑。將佐劑與OprF蛋白充分乳化，直至冰水中不擴(kuò)散為止。首次免疫10 d后進(jìn)行第2次免疫，7 d后進(jìn)行第3次加強(qiáng)免疫。第3次免疫7 d后，小鼠眼球取血的方法獲得血清，置于4℃冰箱中過夜析出，離心取上清，最后將血清保存于-80℃冰箱中備用。

1.2.6 ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià) 利用ELISA酶聯(lián)法檢測(cè)抗血清效價(jià)，主要步驟為：將復(fù)性的OprF蛋白溶解至0.05 μg/μL，于對(duì)應(yīng)的96孔板中加入100μL，37℃作用1 h，排空液體，加入200 μL封閉液，37℃孵育2 h，然后每孔加100 μL不同稀釋度的小鼠一抗血清（對(duì)照加入PBS溶液），并且同一稀釋度血清采用3個(gè)重復(fù)；37℃孵育30 min；洗滌后加入100 μL二抗，37℃孵育30 min；加入50 μL底物A（雙氧水）與50 μL底物B（TMB）的混合液，37℃避光顯色10 min，最后加入終止液，450 nm讀數(shù)［10］。

1.2.7 Western blotting法檢測(cè)抗體特異性 Western blotting顯色方法檢測(cè)小鼠OprF抗血清特異性［11］。為消除pET-28a質(zhì)粒上自帶的His標(biāo)簽蛋白所產(chǎn)生抗體的影響，采用綠膿桿菌OprF蛋白進(jìn)行特異性檢測(cè)。主要步驟為：收集培養(yǎng)的綠膿桿菌，加入上樣緩沖液，沸水中煮樣5 min，上樣10 μL進(jìn)行蛋白電泳，然后轉(zhuǎn)NC膜，與不同稀釋度的小鼠抗血清（對(duì)照加入陰性抗血清）相作用，洗滌后，加入二抗孵育，最后DAB顯色，確定OprF抗血清的特異性。

1.2.8 OprF蛋白序列系統(tǒng)發(fā)生分析 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的細(xì)菌OprF蛋白氨基酸序列，利用DNA MAN軟件進(jìn)行同源性分析；通過MEGA5.02軟件，并結(jié)合Neighbour-Joining 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹［10］。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以綠膿桿菌基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增oprF基因。獲得約1 053 bp的基因片段，與目的基因大小一致（圖1）。將pET-28a質(zhì)粒與PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切后，連接酶連接轉(zhuǎn)化E. coli DH5α菌株，提取重組質(zhì)粒，雙酶切檢測(cè)獲得約1 053 bp片段（圖2），與目的基因大小一致。此外，重組基因的測(cè)序結(jié)果顯示與NCBI公布的基因序列一致。

圖1 綠膿桿菌oprF基因PCR擴(kuò)增

圖2 OprF重組質(zhì)粒的雙酶切檢測(cè)

2.2 重組蛋白的表達(dá)檢測(cè)與蛋白純化

將檢測(cè)確認(rèn)的含有OprF重組質(zhì)粒的菌株經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳獲得約38 kD的蛋白條帶，重組蛋白表達(dá)大小情況與預(yù)期一致；并利用SDSPAGE蛋白電泳切膠的方法獲得OprF蛋白，經(jīng)尿素梯度復(fù)性獲得純化的OprF蛋白（圖3）。

圖3 OprF蛋白的表達(dá)與純化

2.3 OprF蛋白的小鼠抗血清效價(jià)檢測(cè)

將純化的OprF蛋白免疫小鼠，獲得的抗血清經(jīng)ELISA法檢測(cè)。結(jié)果（圖4）表明，其抗體效價(jià)達(dá)到1∶12 800倍。

2.4 OprF蛋白小鼠抗血清的特異性檢測(cè)

利用Western blotting顯色技術(shù)，發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌株與不同稀釋度的OprF抗血清作用后有蛋白條帶顯現(xiàn)，而對(duì)照組未出現(xiàn)（圖5），表明OprF小鼠多克隆抗體特異性較好。

圖4 OprF多克隆抗體效價(jià)的檢測(cè)

圖5 W estern blotting檢測(cè)OprF多克隆抗體特異性

2.5 OprF蛋白的氨基酸序列分析

利用DNAMAN軟件，對(duì)NCBI公布的10種細(xì)菌的OprF蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)不同的細(xì)菌OprF存在較高的同源性，尤其C端不同種細(xì)菌同源性更高；假單胞菌屬細(xì)菌的同源性明顯高于其它屬細(xì)菌（食烷菌）。采用MEGA軟件構(gòu)建的OprF系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果（圖7）顯示，假單胞菌屬的親緣關(guān)系相對(duì)于食烷菌更近。

圖6 OprF蛋白氨基酸序列的多重比對(duì)

3 討論

綠膿桿菌是醫(yī)院感染最常見的條件致病菌之一［12，13］，其耐藥性的不斷增加，給防治帶來一定的困難［14］。OprF為綠膿桿菌主要外膜蛋白之一，具有很強(qiáng)的免疫原性［5，15］，動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)表明其激活機(jī)體產(chǎn)生的特異性免疫能有效抵抗綠膿桿菌的感染［7，8］；且自身無耐藥性等特點(diǎn)［16，17］，在疫苗上具有研究?jī)r(jià)值。然而，獲得抗體是OprF蛋白免疫學(xué)功能研究的基礎(chǔ)。有實(shí)驗(yàn)成功制備了OprF的單克隆抗體，但制備程序復(fù)雜［18］，某些實(shí)驗(yàn)也無需使用單抗。多克隆抗體以其成本低、周期短及效果好等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛運(yùn)用［19］。目前，使用原核表達(dá)蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體仍是最常見的手段之一［20］。本實(shí)驗(yàn)利用分子方法獲得OprF原核表達(dá)載體，純化OprF蛋白，并成功制備與鑒定多克隆抗體；但獲得的抗體滴度較低，因而采用多只小鼠免疫的方式，以抵消滴度低的影響。為進(jìn)一步研究OprF蛋白免疫學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

圖7 MEGA軟件構(gòu)建的OprF氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化

OprF蛋白具有重要的生物學(xué)功能，在遺傳進(jìn)化上具有相對(duì)保守性。本研究通過OprF系統(tǒng)進(jìn)化研究證實(shí)不同菌株的氨基酸序列具有很高的同源性，并且C端同源性更高，這可能與其執(zhí)行特定的功能有關(guān)；研究還證實(shí)假單胞菌屬細(xì)菌的同源性高于其他屬的細(xì)菌。這些發(fā)現(xiàn)為OprF蛋白的交叉免疫保護(hù)作用研究提供依據(jù)。因而，可結(jié)合后續(xù)的免疫攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)，為開發(fā)廣譜抑菌的OprF蛋白疫苗制劑研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

利用分子克隆方法獲得綠膿桿菌外膜蛋白OprF表達(dá)菌株；通過SDS-PAGE電泳切膠純化、尿素梯度復(fù)性獲得OprF蛋白，免疫小鼠制備OprF蛋白多克隆抗體。ELISA法結(jié)果顯示，OprF抗血清滴度達(dá)1∶12 800倍，Western blotting證實(shí)抗血清具有很好的特異性。采用DNAMAN軟件對(duì)OprF序列同源性分析發(fā)現(xiàn)其C端在不同細(xì)菌間存在較高同源性；MEGA軟件對(duì)OprF的系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬細(xì)菌的親緣關(guān)系高于其它屬細(xì)菌。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Expression and Purification of Outer M embrane Lipoprotein OprF in Recombinant Pseudomonas aeruginosa，and Preparation and Identification of Polyclonal Antibody

Chen Chunlin Liu Xiang Ju Xiong
（College of Biological Sciences and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong723001）

The outer membrane lipoprotein of Pseudomonas aeruginosa（OprF）could antagonize bacterial infection by efficiently activating body immunologic mechanism， and therefore has an important perspective in vaccine development. The expression strain for OprF protein of P. aeruginosa was obtained by molecular clone；OprF protein was purified by the way of SDS-PAGE gel extraction and urea gradient renaturation， and the purified protein was used to immunize mice to prepare the polyclonal antibody. The titer of OprF antibody was 1∶12 800 according to ELISA， and Western blotting proved that the antiserum had good specificity. Homology analysis of OprF by DNAMAN showed that the C-terminal regions shared high homology in different bacteria. Phylogenetic analysis by MEGA revealed that genetic relationship with Pseudomonas genus bacteria was higher than that with others.

OprF protein；polyclonal antibody；ELASA；Western blotting；phylogenetic analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.031

2015-03-20

陜西省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃（2013JK0723），陜西理工學(xué)院人才啟動(dòng)項(xiàng)目（SLGQD13-15）

陳春琳，女，碩士研究生，研究方向：分子生物學(xué)；E-mail：chen2362505579@163.com

劉祥，男，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：蛋白質(zhì)組學(xué)與免疫學(xué)；E-mail：liuxiang888525@163.com