蘇甲林闕彪張繼勤李錦輝王敏紀(jì)衛(wèi)東

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東省泌尿外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州　510230；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州　510080）

建立CRISPR/Cas9慢病毒系統(tǒng)高效敲除人源AIP1基因

蘇甲林1闕彪1張繼勤2李錦輝1王敏2紀(jì)衛(wèi)東2

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東省泌尿外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510230；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州510080）

旨在構(gòu)建AIP1基因CRISPR/Cas9敲除體系，獲得高效、穩(wěn)定、永久性AIP1敲除的人胚腎細(xì)胞株（293T）。針對(duì)AIP1的外顯子設(shè)計(jì)3個(gè)20 bp的sgRNA（sp1、sp2和sp3）。與PX458載體連接，構(gòu)建PX458-sgRNA敲除表達(dá)載體。T7E1實(shí)驗(yàn)評(píng)估敲除效率。將敲除效率最高的sgRNA與lentiCRISPRv2慢病毒載體連接，構(gòu)建lentiCRISPRv2-sgRNA敲除表達(dá)載體，將陽性重組質(zhì)粒導(dǎo)入病毒包裝細(xì)胞293T中，收集病毒上清液轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。對(duì)敲除成功的293T細(xì)胞通過有限稀釋法構(gòu)建敲除AIP1基因的穩(wěn)定細(xì)胞株。Western blot測定轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞中AIP1蛋白的表達(dá)量。結(jié)果顯示，測序證實(shí)AIP1的3個(gè)靶序列分別正確插入PX458表達(dá)載體中，T7E1實(shí)驗(yàn)證實(shí)AIP1sgRNAsp2靶向敲除效率最高；成功構(gòu)建lentiCRISPRv2-sgRNAsp2 AIP1敲除表達(dá)載體，并包裝病毒，感染293T細(xì)胞；Western blot證實(shí)獲得穩(wěn)定的AIP1基因表達(dá)缺失的293T細(xì)胞株。建立了能穩(wěn)定敲除AIP1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系統(tǒng)，成功獲得AIP1敲除的293T穩(wěn)定細(xì)胞株。

CRISPR/Cas9；慢病毒；AIP1；穩(wěn)定細(xì)胞株

AIP1（Apoptosis signal-regulating kinase 1-interacting protein-1，又稱為DAB2IP）是近來鑒定的Ras-GTP酶活化蛋白家族新成員，其基因定位于人染色體9q33.1-9q33.3上，含有1個(gè)開放閱讀框架，cDNA全長6.3 kb，編碼1 065個(gè)氨基酸、分子量為120 kD左右的蛋白質(zhì)。AIP1蛋白的N端有參與膜蛋白定位的PH結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞信號(hào)凋亡調(diào)節(jié)酶1結(jié)合有關(guān)C2結(jié)構(gòu)域和抑制Ras信號(hào)通路的GAP結(jié)構(gòu)域；C端有抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號(hào)通路有關(guān)的PER結(jié)構(gòu)域和調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路的PR結(jié)構(gòu)域［1］。AIP1是新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，它通過介導(dǎo)多種腫瘤相關(guān)信號(hào)通路，如MAPK-ERK、PI3K-Akt、ASKl-JNK和GSK-3β-β-catenin等，影響細(xì)胞的增殖、存活和凋亡［2-4］。研究發(fā)現(xiàn)AIP1在前列腺癌、肝細(xì)胞癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［5-9］。

目前，普遍使用基因敲減技術(shù)敲低目的細(xì)胞AIP1基因研究AIP1基因功能，但是基因敲減技術(shù)僅影響mRNA降解，不能完全沉默目的細(xì)胞AIP1基因的表達(dá)，對(duì)充分研究AIP1基因功能有一定的局限性。本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建AIP1基因敲除質(zhì)粒，并用慢病毒系統(tǒng)進(jìn)行包裝，旨在建立CRISPR/Cas9慢病毒系統(tǒng)敲除人源性細(xì)胞系A(chǔ)IP1基因的方法，為深入研究AIP1基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細(xì)胞株（293T）購于美國ATCC細(xì)胞庫，PX458和lentiCRISPRv2質(zhì)粒購于Addgene公司，Bbs I酶、Bsm B I酶、T4 DNA連接酶和T7E1酶購自New England Biolabs（NEB）公司，質(zhì)粒抽提試劑盒購自Qiagen公司，DNA提取試劑盒購自TaKaRa公司，Lipofectamine? 2000試劑、高糖.DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶均購自Gibco公司，寡核苷酸序列由上海捷瑞公司合成。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA寡核苷酸鏈合成 我們使用CRISPR在線設(shè)計(jì)工具（http：//crispr.mit.edu/）根據(jù)評(píng)分系統(tǒng)，分別在AIP1的外顯子6和16設(shè)計(jì)3個(gè)20 bp的sgRNA（sp1、sp2和sp3）（圖1）。分別在編碼鏈模板5'端添加CACCG，非編碼鏈模板5'端添加AAAC，3'端添加C，設(shè)計(jì)3對(duì)CRISPR寡核苷酸鏈，由上海捷瑞公司合成。設(shè)計(jì)sgRNA及序列見表1。

圖1 CRISPR/Cas靶序列在AIP1基因的位點(diǎn)及擴(kuò)增靶序列位點(diǎn)引物示意圖

表1 AIP1靶向位點(diǎn)及sgRNA寡核苷酸序列

1.2.2 載體構(gòu)建 將兩條sgRNA寡核苷酸單鏈化學(xué)合成雙鏈，連接至Bbs I酶切線性化的PX458質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化到stbl3感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性單克隆菌落抽提質(zhì)粒并送廣州艾基生物測序驗(yàn)證。將重組質(zhì)粒分別命名為：PX458-sgRNAsp1、PX458-sgRNAsp2和PX458-sgRNAsp3。將sgRNAsp2與Bsm B I酶切后的lentiCRISPRv2載體使用上述方法連接，并測序驗(yàn)證。

1.2.3 敲除效率驗(yàn)證 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染：293T細(xì)胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基于5% CO2，37℃恒溫培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞以5×105/孔接種到6孔板培養(yǎng)，將其分組為：PX458（陰性對(duì)照組）、PX458-sgRNAsp1、PX458-sgRNAsp2和PX458-sgRNAsp3。將相應(yīng)的敲除質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒各2 μg經(jīng)Lipofectamine? 2000試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后消化收集各組細(xì)胞，提取基因組DNA。采用T7E1實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證敲除效率：根據(jù)BLAST分別設(shè)計(jì)3條靶向序列的引物（表2）。PCR擴(kuò)增目的片段，純化后使用PCR儀進(jìn)行變性退火。加入10 U T7E1酶，37℃水浴15 min，加入2 μL 0.5 mol/L EDTA終止反應(yīng)。使用2%的瓊脂糖凝膠DNA電泳，檢測敲除效率。

1.2.4 慢病毒載體包裝 將重組質(zhì)粒lentiCRISPRv2-sgRNAsp2和lentiCRISPRv2空載體各1.2 μg分別與包裝質(zhì)粒pCMV-R8.2 0.6 μg及輔助質(zhì)粒VSV-G 1.2 μg混合，分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；轉(zhuǎn)染12 h后，棄去培養(yǎng)基，加入3 mL培養(yǎng)基置37℃繼續(xù)培養(yǎng)；48 h后收集，0.45 μm濾器過濾并分裝病毒上清液。加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；24 h后再次收集含病毒上清液的培養(yǎng)基。-80℃保存。

表2 擴(kuò)增靶序列引物

1.2.5 嘌呤霉素對(duì)293T細(xì)胞的最小致死量篩選 將293T細(xì)胞種入6孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，按照下列濃度加入嘌呤霉素（μg/mL）：0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5，隔天換液，并保持培養(yǎng)基的嘌呤霉素濃度恒定。第3天能夠使293T細(xì)胞全部死亡的最小濃度為1.0 μg/mL。

1.2.6 構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株 待293T細(xì)胞融合度達(dá)到50%時(shí)更換1 mL培養(yǎng)基，加入1 mL病毒上清液和1.6 mL polybrene（終濃度8 μg/mL），6 h后換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。48 h后重復(fù)感染一次，感染完畢后換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。48 h后加入嘌呤霉素（1.0 μg/mL），維持嘌呤霉素濃度7 d，對(duì)于篩選出的陽性克隆，消化收集各孔細(xì)胞并計(jì)數(shù)，采用有限稀釋法稀釋至終濃度為每100 μL培養(yǎng)基0.5個(gè)細(xì)胞，按每孔200 μL細(xì)胞稀釋液加至96孔板［10］。顯微鏡下觀察只含有單個(gè)細(xì)胞的孔并標(biāo)記。待單個(gè)細(xì)胞生長至細(xì)胞團(tuán)時(shí)逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，取少量細(xì)胞提取基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后測序與野生型基因組對(duì)比，檢測AIP1是否成功敲除。對(duì)缺失突變堿基最多的細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取細(xì)胞蛋白，Western blot 檢測單克隆細(xì)胞AIP1蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒載體的檢測結(jié)果

分別在AIP1的3條靶序列添加粘性末端，化學(xué)合成sgRNAsp1、sgRNAsp2和sgRNAsp3與酶切后的PX458質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化到stbl3感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性單克隆菌落抽提質(zhì)粒。廣州艾基生物公司測序結(jié)果（圖2）顯示，sgRNAsp1、sgRNAsp2和sgRNAsp3分別正確插入pX458載體中。

2.2 AIP1靶向序列的篩選

將PX458空載體及PX458-sgRNAsp1、PX458-sgRNAsp2和PX458-sgRNAsp3分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡下觀察4組293T細(xì)胞都有綠色熒光蛋白表達(dá)（圖3），消化收集各組細(xì)胞，提取基因組DNA。PCR擴(kuò)增含有sgRNA的目的片段，純化后加入T7E1酶反應(yīng)，瓊脂糖凝膠DNA電泳發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較sgRNAsp1、sgRNAsp2和sgRNAsp3都有兩條切開的條帶，其中sgRNAsp2切開效果最顯著，表明AIP1sgRNAsp2靶向敲除效率最高（圖4）。

2.3 構(gòu)建敲除AIP1基因的293T穩(wěn)定細(xì)胞株

為了提高轉(zhuǎn)染效率，將sgRNAsp2連接到lentiCRISPRv2慢病毒質(zhì)粒，和空載體分別轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，收集病毒液，感染正常293T細(xì)胞，嘌呤霉素篩選出陽性克隆，有限稀釋法稀釋至單個(gè)細(xì)胞，逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)出6個(gè)單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株與其野生型基因組DNA比較，發(fā)現(xiàn)目的片段中出現(xiàn)了不同堿基數(shù)的缺失突變和插入突變（圖5）。

對(duì)缺失突變堿基最多的細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取細(xì)胞蛋白，Western blot檢測敲除AIP1基因的293T細(xì)胞與對(duì)照組比較，發(fā)現(xiàn)AIP1蛋白表達(dá)缺失（圖6），表明已敲除393T細(xì)胞中AIP1基因。

3 討論

隨著生物學(xué)研究的發(fā)展，基因組編輯技術(shù)為了解特定基因的功能提供了基礎(chǔ)。目前ZFNs和TALENs技術(shù)突破了傳統(tǒng)的基因組定點(diǎn)編輯，但其具體操作對(duì)實(shí)驗(yàn)要求較高，耗時(shí)較長，較難廣泛普及。而CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以對(duì)任何后面緊隨NGG（PAM）的20 bp的序列進(jìn)行編輯，能同時(shí)作用于多個(gè)靶位點(diǎn)［11］。此外，載體構(gòu)建簡單，針對(duì)特定基因位點(diǎn)只需要設(shè)計(jì)sgRNA，不需要對(duì)每個(gè)基因編輯位點(diǎn)都設(shè)計(jì)和組裝兩個(gè)核酸酶。CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有簡單靈活、特異性高、細(xì)胞毒性低等特點(diǎn)，可以對(duì)特定基因組位點(diǎn)進(jìn)行切割置換［12］。與RNAi技術(shù)比較，CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過RNA識(shí)別DNA 序列然后再改變DNA序列是可以遺傳的［13］。本研究構(gòu)建的lentiCRISPRv2-sgRNAsp2質(zhì)粒攜帶有化膿性鏈球菌Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)的Cas9核酸內(nèi)切酶基因，在轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞后可以表達(dá)該核酸內(nèi)切酶。通過T7E1實(shí)驗(yàn)檢測sgRNA靶位點(diǎn)的切割效率，發(fā)現(xiàn)sgRNAsp2在AIP1基因目的位點(diǎn)產(chǎn)生切割的效率高達(dá)51.8%。連接sgRNAsp2到慢病毒lentiCRISPRv2載體，更高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞。在細(xì)胞亞克隆中，有6個(gè)單克隆細(xì)胞基因組在目的片段中出現(xiàn)了不同堿基數(shù)的突變。對(duì)缺失突變堿基最多的細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，建立穩(wěn)定敲除AIP1的293T細(xì)胞株。

圖2 質(zhì)粒序列測序圖

圖3 PX458空載及3組PX458-sgRNA轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞

圖4 檢測3個(gè)sgRNA的靶向敲除效率

圖5 單克隆細(xì)胞在目的sgRNA位點(diǎn)的缺失突變

圖6 穩(wěn)定細(xì)胞株中AIP1蛋白的表達(dá)

將目的基因連接到載體并轉(zhuǎn)染至目的細(xì)胞是獲得長期穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的關(guān)鍵步驟。目前，轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞常用的基因?qū)胼d體主要是質(zhì)粒載體和病毒載體。質(zhì)粒載體適用于短時(shí)間的活細(xì)胞示蹤，轉(zhuǎn)染率相對(duì)較低，且對(duì)目的基因干預(yù)作用弱。與質(zhì)粒載體相比，病毒載體具有轉(zhuǎn)染率高、目的基因長期穩(wěn)定表達(dá)及適用范圍廣等優(yōu)勢。因此，越來越多的研究人員更傾向于使用病毒載體轉(zhuǎn)染，包括腺病毒、慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒3種表達(dá)系統(tǒng)，其中慢病毒載體系統(tǒng)適用細(xì)胞類型廣泛，可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因，能整合外源基因進(jìn)入目的細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定表達(dá)，是目前基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用研究中使用最廣泛的一類載體。本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)染率，成功的獲得長期、穩(wěn)定敲除AIP1基因的細(xì)胞株。

最近研究發(fā)現(xiàn)，AIP1作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，不僅在腫瘤細(xì)胞的增殖存活和凋亡過程中扮演著重要角色，還參與調(diào)控動(dòng)脈硬化、腹主動(dòng)脈瘤及早發(fā)性心肌梗死等多種非腫瘤性疾病的發(fā)生發(fā)展［14，15］。本研究構(gòu)建目的細(xì)胞AIP1基因敲除的細(xì)胞系，是深入研究AIP1基因功能的前提基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)合慢病毒系統(tǒng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染功能和CRISPR/Cas9系統(tǒng)的敲除功能，建立了CRISPR/Cas9慢病毒系統(tǒng)，充分發(fā)揮了慢病毒包裝系統(tǒng)與Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢，永久性敲除目的細(xì)胞AIP1基因，獲得敲除AIP1基因的穩(wěn)定細(xì)胞株。證實(shí)了CRISPR/Cas9慢病毒系統(tǒng)的可行性，為進(jìn)一步構(gòu)建其他AIP1基因敲除的人源性細(xì)胞系提供了一種簡單、高效的方法。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Establishment of a CRISPR/Cas9 Lentiviral System for Knockout Gene AIP1 of Human

Su Jialin1Que Biao1Zhang Jiqin2Li Jinhui1Wang Min2Ji Weidong2
（1. The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangdong Key Laboratory of Urology，Guangzhou510230；2. The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou510080）

This work aims to establish the CRISPR/Cas9 system of knocking out gene AIP1 for producing nephocyte cell（293T）of human embryo in which gene AIP1 efficiently， stably and permanently is knocked out. Three 20 bp sgRNAs（sp1， sp2 and sp3）targeting AIP1 exons were designed and inserted in PX458 vector to construct PX458-sgRNA expression vector for knockout. CRISPR/Cas9 efficiency of knockout was assessed using T7E1 assay. sgRNA of the maximum knockout efficiency was inserted into lentiCRISPRv2 vector to construct lentiCRISPRv2-sgRNA expression vector. The correct recombinant plasmid was transfected into 293T cells. The supernatant was collected and filtered， and then infected the 293T cells. The stable 293T cell lines were generated by limiting diluting the cells in which genes AIP1 were knocked out successfully. The expression level of AIP1 in the stable 293T cells were detected by Western blot. Three sgRNAs of AIP1 were correctly inserted into PX458 vector respectively， T7E1 verified that the knockout rate of AIP1sgRNAsp2 was the maximum. LentiCRISPRv2-sgRNAsp2 expression vector of AIP1-knockout was successfully constructed， and infected 293T cells. The stable 293T cell lines with AIP1-expression-deficient were obtained by Western blot. In conclusion， the stable 293T cell lines of AIP1-knockout were successfully generated by CRISPR/Cas9 system， which provides the foundation for further studying the functions of AIP1 gene.

CRISPR/Cas9；lentiviral；AIP1；stable cell lines

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.032

2015-04-14

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81272350，81472999）

蘇甲林，男，學(xué)士，研究方向：泌尿系腫瘤與表觀遺傳學(xué)；E-mail：sujialin125@126.com

紀(jì)衛(wèi)東，男，博士，研究方向：泌尿系腫瘤與表觀遺傳學(xué)；E-mail：wdji2008@163.com