程知慶 沈和定 姚理想 刁亞 劉宸

（上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上?！?01306）

瘤背石磺多糖提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

程知慶 沈和定 姚理想 刁亞 劉宸

（上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201306）

采用傳統(tǒng)的熱水浸提法提取瘤背石磺多糖，運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化多糖的提取工藝，并以粗多糖對(duì)其體外抗氧化活性作初步研究。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，探討浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比對(duì)瘤背石磺多糖提取率的影響并選取實(shí)驗(yàn)水平，采用 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，利用Design-Expert 8.05軟件分析數(shù)據(jù)。通過(guò)清除羥基自由基和 DPPH自由基的能力來(lái)檢測(cè)多糖抗氧化性能。結(jié)果顯示，最佳水提條件為浸提溫度92℃、浸提時(shí)間30 h、料液比1∶29（g/mL），在最優(yōu)工藝條件下瘤背石磺多糖的提取率為9.206%，瘤背石磺多糖對(duì)羥基自由基和DPPH自由基都具有一定的清除率。采用該方法優(yōu)化提取多糖，合理可靠，為以后的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，且多糖具有明顯的體外抗氧化活性。

瘤背石磺；多糖；提取工藝；響應(yīng)面法；抗氧化

瘤背石磺（Onchidium struma）俗稱(chēng)土海參、海癩子、土雞、烏紗鱉、涂龜、土鮑等，屬于軟體動(dòng)物門(mén)（Mollusca）腹足綱（Gastropoda）肺螺亞綱（Pulmonata）柄眼目（Stylommatophora）石磺科（Onchidiidae），全身裸露無(wú)殼，是用肺呼吸的一種進(jìn)化貝類(lèi)［1］。在我國(guó)主要分布于江蘇、上海、浙江、福建、廣東、香港、海南、廣西等地，其生長(zhǎng)在陸地和海洋的過(guò)渡帶，分布于灘涂潮間帶高潮線(xiàn)附近。民間流傳瘤背石磺具有滋補(bǔ)、壯陽(yáng)、清涼、祛火、祛濕等功效［2-4］。營(yíng)養(yǎng)成分分析結(jié)果表明，瘤背石磺具有較高的藥用價(jià)值和保健作用［5］。

研究發(fā)現(xiàn)貝類(lèi)多糖也具有多種生物活性及藥用價(jià)值，紫貽貝［6］多糖具有良好的抗氧化活性；范秀萍［7］研究發(fā)現(xiàn)波紋巴非蛤多糖（PUG-1）對(duì)高脂模型小鼠具有較好的降低血脂與預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化作用，貝類(lèi)多糖還具有如抗腫瘤［8-10］、抗病毒［11］、抗衰老［12］等生物活性，從生物體內(nèi)提取出來(lái)的多糖對(duì)正常細(xì)胞毒副作用小，多糖藥物的研制成為當(dāng)今世界新藥的重要發(fā)展方向之一，從而使多糖生物資源的開(kāi)發(fā)和利用成為了研究熱點(diǎn)。管菊［13］在研究中發(fā)現(xiàn)瘤背石磺中的總糖含量約為26.06%，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于石磺的研究主要集中在系統(tǒng)分類(lèi)、生物學(xué)特性、受精機(jī)制、繁殖、胚胎發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等方面，其多糖的提取、工藝條件優(yōu)化及其生物活性的研究報(bào)道幾乎沒(méi)有。考慮到實(shí)際實(shí)驗(yàn)的可操作性及實(shí)驗(yàn)室儀器的局限性，綜合考量最后采取經(jīng)典的多糖提取法——熱水浸提醇沉法，該法具有經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、容易操作，儀器設(shè)備易得的優(yōu)點(diǎn)。李雪梅［14］利用熱水浸提法提取出扇貝中的水溶性多糖，并對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。本研究采用熱水浸提法提取瘤背石磺中的多糖，通過(guò)響應(yīng)面法［15，16］實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)多糖的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)粗多糖的體外抗氧化能力做初步測(cè)定，以期為瘤背石磺生物活性物質(zhì)的研究和開(kāi)發(fā)提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 瘤背石磺預(yù)處理 瘤背石磺（采自上海崇明島）解剖去其內(nèi)臟，置于-80℃的低溫下備用。

1.1.2 試劑 無(wú)水葡萄糖、苯酚、濃硫酸、1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH自由基）、水楊酸、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫等化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 儀器 多功能粉碎機(jī)（永康市小寶電器有限公司），AL104電子分析天平（精確至 0.0001 g，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），美譜達(dá) UV-6100 型紫外分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司），DHG-9077A型電熱恒溫干燥箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），HWS-26雙列六孔恒溫水浴鍋（上海慧泰儀器制造有限公司），TDL-40B低速臺(tái)式大容量離心機(jī)（上海圣科儀器設(shè)備有限公司），MLLI-Q超純水儀（美國(guó) Millipore 公司）。

1.2 方法

1.2.1 瘤背石磺粗多糖的提取工藝流程 瘤背石磺→絞碎→石油醚浸泡12 h→乙醇浸泡4 h→50℃烘箱烘干→水浴浸提→過(guò)濾離心→取上清液→濃縮→脫蛋白（Sevage 試劑脫蛋白）→離心（除蛋白）→透析（4 d）→濃縮→醇沉（加入4倍體積95%乙醇，4℃靜置過(guò)夜）→離心 45℃恒溫干燥→灰白色瘤背石磺粗多糖。

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的描繪 多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法［17］，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖1），得回歸方程為：y=0.0075x+0.0012，R2=0.9927，結(jié)果表明，葡萄糖的微克含量在16-72 μg范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好。

1.2.3 瘤背石磺提取液中多糖含量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取瘤背石磺干燥粉1 g，放入50 mL的錐形瓶中，按照設(shè)定的料液比加入蒸餾水，在設(shè)定的時(shí)間和溫度下提取，過(guò)濾離心分離，取上清液，按照苯酚-硫酸法測(cè)定并計(jì)算提取液中多糖的含量。計(jì)算方程如下：

多糖的提取率（%）=C×N×V/M×10-3×100%式中，C為待測(cè)液的濃度；N為稀釋倍數(shù)；V為待測(cè)液體積；M為樣品質(zhì)量。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 通過(guò)熱水浸提法，分別考察料液比（20、30、40、50和60 mL/g），提取溫度（80、85、90、95和100℃），提取時(shí)間（15、20、25、30和35 h）這3個(gè)因素進(jìn)行單因素的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，采用苯酚-硫酸法測(cè)石磺多糖濃度，以多糖得率為指標(biāo)，考察各個(gè)因素對(duì)瘤背石磺多糖得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 在上述單因素基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken Design（BBD）中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)出3因素3水平實(shí)驗(yàn)方案［18］。以瘤背石磺多糖的提取率為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.05 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出最佳提取工藝條件。實(shí)驗(yàn)因子和水平，見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平表

1.2.6 瘤背石磺多糖體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定 參照陳玉琴等［19］的實(shí)驗(yàn)方法，略有改動(dòng)，降低了其中DPPH自由基的濃度為0.5 mmoL/L，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，求取平均值，以VC作對(duì)比。

清除率（%）=［1-（A樣品-A空白）/A對(duì)照］×100% 1.2.6.2 清除羥基自由基能力的測(cè)定 參考李粉玲等［20］的實(shí)驗(yàn)方法，略有改動(dòng)，10倍稀釋了實(shí)驗(yàn)試劑的濃度，并延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至30 min。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，求取平均值，以VC作對(duì)比。

清除率（%）=［1-（A樣品-A空白）/A對(duì)照］×100%

2 結(jié)果

2.1 瘤背石磺多糖提取的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 溫度對(duì)總糖得率的影響 圖1顯示，隨著浸提溫度的提高，瘤背石磺多糖的提取率明顯增高，當(dāng)溫度高于90℃時(shí)，多糖的提取率增加相對(duì)緩慢。由于加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，受實(shí)驗(yàn)條件限制，溫度最高只能穩(wěn)定在95℃，所以浸提溫度選擇85℃-95℃。

圖1 浸提溫度對(duì)瘤背石磺多糖提取率的影響

2.1.2 時(shí)間對(duì)總糖得率的影響 圖2顯示，隨浸提時(shí)間的延長(zhǎng)瘤背石磺多糖的提取率不斷提高，浸提時(shí)間達(dá)到30 h，提取率達(dá)到最大值。隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率下降。故選擇浸提時(shí)間在30 h左右。

2.1.3 料液比對(duì)總糖得率的影響 圖 3 顯示，當(dāng)料液比低于30 mL/g時(shí)，多糖的提取率一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在料液比為30 mL/g時(shí)提取率達(dá)到最高，隨著料液比的繼續(xù)增大，提取率降低。故選擇30 mL/g為響應(yīng)面的最優(yōu)值。

圖2 浸提時(shí)間對(duì)瘤背石磺多糖提取率的影響

圖3 料液比對(duì)瘤背石磺多糖提取率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比3個(gè)因素為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的自變量，以多糖提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。利用Design expert 8.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和回歸分析，結(jié)果如表2所示。

2.2.1 模型方程的建立與顯著性檢驗(yàn) 通過(guò)Design-Expert 8.05軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到多糖提取率對(duì)浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比3個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程為：

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果（表3）顯示，P＜0.000 1，表明模型極顯著；失擬項(xiàng)P=0.576 5＞0.05，沒(méi)有顯著性，說(shuō)明所選的模型對(duì)該實(shí)驗(yàn)擬合程度較好，誤差較小。其中模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.990 0，校正后的R2=0.977 2，說(shuō)明該模型可以解釋97.72%的響應(yīng)值Y的變化，預(yù)測(cè)R2值0.932 5與校正的值0.977 2相差不大，表明實(shí)驗(yàn)的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值擬合的較好。

表2 瘤背石磺多糖提取率的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

表3 擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析

A、B、C三個(gè)因素的一次項(xiàng)均小于0.01，說(shuō)明這3個(gè)因素對(duì)多糖提取率都極顯著。交互項(xiàng)AB、AC都小于0.01，均達(dá)到了極顯著的水平，BC小于0.05達(dá)到顯著水平，3個(gè)因素的二次項(xiàng)均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），說(shuō)明3個(gè)因素之間都存在一定的交互作用，且因素之間的交互作用對(duì)多糖提取率都顯著影響。表3的方差分析顯示，3個(gè)因素對(duì)瘤背石磺多糖提取率的影響程度依次為A（浸提溫度）＞C（料液比）＞B（浸提時(shí)間）。

2.2.2 瘤背石磺多糖的響應(yīng)面分析 利用 Design Expert 8.05軟件，繪制各影響因素對(duì)瘤背石磺多糖的響應(yīng)曲面圖，根據(jù)響應(yīng)曲面的坡度和等高線(xiàn)的形狀可以比較判斷各因素及其交互作用對(duì)提取率影響的強(qiáng)弱。該擬合方程的二次項(xiàng)系數(shù)都是負(fù)數(shù)，所以圖4-圖6中每個(gè)響應(yīng)曲面都是開(kāi)口向下的凸形曲面，等高線(xiàn)沿某一因素軸方向曲線(xiàn)的疏密程度反映在響應(yīng)曲面上表現(xiàn)為曲面的陡峭程度，等高圖上曲線(xiàn)越密，響應(yīng)曲面則越陡，說(shuō)明響應(yīng)值對(duì)該因素的變化較敏感，圖4-圖6中的響應(yīng)面3D圖顯示，當(dāng)各因素在一定范圍內(nèi)增大時(shí)，響應(yīng)值也隨之增大，當(dāng)各因素超出響應(yīng)面極值繼續(xù)增加時(shí)，響應(yīng)值則減小，等高圖中的中心點(diǎn)投影在3D圖中為最高點(diǎn)，則該點(diǎn)的提取率最高，而根據(jù)等高線(xiàn)圖4-圖6中等高線(xiàn)沿各自軸方向的疏密程度可以比較出各因素的影響力大小分別是：A＞B、A＞C、C＞B。等高線(xiàn)的形狀可反映出交互影響的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反，圖4-圖6中的等高曲線(xiàn)都是橢圓形，說(shuō)明浸提溫度和浸提時(shí)間、浸提溫度和料液比、浸提時(shí)間和料液比之間交互作用較為顯著且各因素之間的交互作用對(duì)多糖的提取率影響顯著。最后得出3種因素對(duì)多糖提取率的影響是：A（浸提溫度）＞C（料液比）＞B（浸提時(shí)間），該結(jié)果與回歸模型顯著性檢驗(yàn)相吻合。

2.2.3 優(yōu)化與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)上述響應(yīng)面的模型與結(jié)果分析，得到最佳條件下的瘤背多糖的提取率為9.206%，其中浸提溫度為91.65℃，浸提時(shí)間29.93 h，料液比29.05 mL/g。為了檢測(cè)響應(yīng)面法所得數(shù)據(jù)的可靠性，同時(shí)也為了實(shí)驗(yàn)操作方便，選取浸提溫度92℃，浸提時(shí)間30 h，料液比29 mL/g。在此條件下，平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次的平均值為（9.062±0.091）%。實(shí)際測(cè)得的平均值與理論預(yù)測(cè)值相差很小，說(shuō)明該模型可靠性高，工藝的重復(fù)性好。

圖4 提取率f=（A，B）響應(yīng)曲面及等高線(xiàn)圖（C=30.00）

圖5 提取率f=（A，C）響應(yīng)曲面及等高線(xiàn)圖（B=30.00）

圖6 提取率f=（B，C）響應(yīng)曲面及等高線(xiàn)圖（A=90.00）

2.3 瘤背石磺多糖體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.3.1 DPPH自由基清除能力 圖7顯示，在測(cè)定的濃度范圍內(nèi)，VC和瘤背石磺多糖對(duì)DPPH自由基都有較強(qiáng)的清除能力，但與多糖相比，VC的清除能力明顯更強(qiáng)且一直維持在較高水平。多糖對(duì)DPPH自由基的清除力隨著瘤背石磺多糖濃度的增加呈正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)濃度大于2 mg/mL時(shí)，多糖對(duì)DPPH自由基的清除率明顯增強(qiáng)。當(dāng)多糖濃度為10 mg/mL時(shí)，清除率最高達(dá)到76.98%。對(duì)DPPH的清除率IC50為4.36 mg/mL。

2.3.2 羥基自由基清除能力 圖8顯示，在測(cè)定的多糖濃度范圍內(nèi)，瘤背石磺多糖和VC均對(duì)羥基自由基有較強(qiáng)的清除力。與多糖相比，VC的清除能力更強(qiáng)且一直維持在較高的水平。瘤背石磺多糖對(duì)羥基自由基的清除力隨多糖濃度的增加而增強(qiáng)，最高清除率達(dá)到80%。說(shuō)明瘤背石磺多糖對(duì)羥基自由基的清除能力達(dá)到較高的水平。對(duì)羥基自由基的清除率IC50為3.12 mg/mL。

圖7 瘤背石磺多糖對(duì)DPPH自由基的清除率

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)瘤背石磺多糖提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。選取3個(gè)影響因素（浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比）進(jìn)行單因素的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，在單因素基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken Design（BBD）中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以多糖提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)出3因素3水平實(shí)驗(yàn)方案，利用Design Expert 8.05軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出最佳提取工藝條件。通過(guò)多糖清除DPPH自由基和羥基自由基的能力來(lái)評(píng)價(jià)多糖的抗氧化活性。

在單因素的實(shí)驗(yàn)中，浸提溫度、浸提時(shí)間和料液比對(duì)多糖提取率的影響均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)浸提溫度低于95℃時(shí)，隨著溫度的逐漸升高，分子的運(yùn)動(dòng)加劇，加快了多糖溶解擴(kuò)散的速度，從而使多糖的提取率上升，所以在適度范圍內(nèi)浸提溫度的升高有利于多糖的提取，但溫度過(guò)高會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)，部分多糖水解為單糖或低聚糖，從而導(dǎo)致多糖提取率下降［21］；在一定的浸提時(shí)間內(nèi)，多糖隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，在水中的溶解度不斷增加，當(dāng)多糖擴(kuò)散達(dá)到平衡時(shí)，多糖的提取率下降，浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響甚至破壞多糖結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致多糖的提取率下降；濃度梯度是提取的動(dòng)力，在一定范圍內(nèi)提高料液比有利于多糖的提取，但當(dāng)料液比超過(guò)某一極限時(shí)，再提高料液比則效果不明顯，同時(shí)考慮到節(jié)約能源，所以選擇最優(yōu)料液比為30 mL/g。

在多糖抗氧化實(shí)驗(yàn)中，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，考察多糖對(duì)兩種自由基的清除能力。首先DPPH自由基由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有十分活潑的單電子，其醇溶液呈紫色，并且在517 nm處有一強(qiáng)吸收峰，瘤背石磺多糖的加入可以捕獲并清除其單電子，導(dǎo)致溶液褪色和吸收強(qiáng)度的減弱［22］；其次根據(jù)Fenton反應(yīng)，H2O2與Fe2+發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成OH·自由基，其存活時(shí)間較短但具有極高的反應(yīng)活性，與水楊酸結(jié)合生成一種在510 nm處有強(qiáng)吸收的有色物質(zhì)，抗氧化劑多糖的加入清除并降低了OH·自由基的濃度，則有色物質(zhì)生成量減少，溶液顏色變淡且吸光度減?。?3］。

4 結(jié)論

利用響應(yīng)面法優(yōu)化瘤背石磺多糖提取的工藝條件，確定多糖的最佳提取工藝為浸提溫度92℃，浸提時(shí)間30 h，料液比29 mL/g，提取率為9.062%。對(duì)瘤背石磺多糖體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，在一定的濃度范圍內(nèi)，多糖對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除能力都較強(qiáng)。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Process Optim ization of Extracting Polysaccharides from Onchidium struma，and Evaluation of Its Antioxidant Activity in Vitro

Cheng Zhiqing Shen Heding Yao Lixiang Diao Ya Liu Chen
（Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources，Shanghai Ocean University，Ministry of Education，Shanghai201306）

Taking Onchidium struma as the raw material， its polysaccharides was extracted by the traditional method of hot water. Process of extracting polysaccharides from O. struma was optimized by response surface methodology. Through the single factor experiment，the effects of extraction temperature， extraction time， and liquor-to-material ratio to the extraction rate of polysaccharide were investigated. Furthermore， the experiments were done by Box-Behnken， and the data was analyzed by Design-Expert 8.05 software. Antioxidant activity of O. struma polysaccharides was determined by the capacity of scavenging free hydroxyl radical and DPPH radical. On the basis of the analysis of regression equation， determination of factors affecting the extraction of polysaccharide was conducted by the extraction rate of polysaccharide served as response value. Extraction temperature at 92℃， extraction time of 30 h， and liquor-to-material ratio of 1∶29 g/mL， leaching rate of O. struma polysaccharide reached 9.206%. O. struma polysaccharide had ability to clear off free hydroxyl radical and DPPH radical. Conclusively，the extraction technology is reasonable and reliable for the extraction of polysaccharides O. struma， which provides the theoretical support for the future industrial production， and its polysaccharides have significant antioxidation in vitro.

Onchidium struma；polysaccharide；extraction；response surface method；antioxidation effect

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.027

2015-01-14

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41276157），上海高校水產(chǎn)學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目

程知慶，女，碩士研究生，研究方向：海洋生物資源研究與開(kāi)發(fā)；E-mail：986256709@qq.com

沈和定，男，博士，教授，研究方向：海洋生物學(xué)；E-mail：hdshen@shou.edu.cn