張鵬遠(yuǎn) 任龍輝 王建光 陳壯壯 鐘宇 陳穗云

（云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明　650091）

薯蕷褪綠壞死花葉病毒CP基因的原核表達(dá)及抗血清的制備

張鵬遠(yuǎn) 任龍輝 王建光 陳壯壯 鐘宇 陳穗云

（云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明650091）

薯蕷褪綠壞死花葉病毒（yam chlorotic necrotic mosaic virus，YCNMV）是馬鈴薯Y病毒科柘橙病毒屬暫定成員。采用RT-PCR方法，以Sprimer/M4簡(jiǎn)并引物對(duì)擴(kuò)增獲得的YCNMV分離物3'端基因組序列為參考序列，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)CP基因特異引物獲得YCNMV CP基因并插入pET-30a表達(dá)載體中，在BL21（DE3）菌株中誘導(dǎo)表達(dá)。獲得的融合蛋白經(jīng)Ni+-NTA柱純化后免疫新西蘭大白兔，制備抗血清。結(jié)果表明，連接在表達(dá)載體中的CP基因序列及表達(dá)的蛋白氨基酸序列與預(yù)期的CP基因核苷酸和氨基酸序列同源性均為99.65%。聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明，獲得的融合蛋白大小約為44 kD，與預(yù)期蛋白大小相符。制備的抗血清經(jīng)Western blotting和ID-ELISA檢測(cè)表明，獲得的多克隆抗體效價(jià)較高，能可靠、靈敏、特異地與YCNMV病毒顆粒結(jié)合，可應(yīng)用到該病毒的檢測(cè)中。

薯蕷褪綠壞死花葉病毒；外殼蛋白；原核表達(dá)；抗血清

薯 蕷（Dioscorea opposite Thunb） 是 薯 蕷 科（Dioscoreaceae）薯蕷屬（Diosorea L.）單子葉纏繞藤本植物，廣泛分布于熱帶至溫帶地區(qū)，是西非、東南亞和南美的主要糧食和經(jīng)濟(jì)作物。小花盾葉薯蕷（Dioscorea parviflora C. T. Ting），又名苦良姜，是云南省特有的薯蕷種類，主要分布于金沙江河谷流域。因其薯蕷皂甙含量較高，具有較高的藥用價(jià)值，近年來(lái)，大量的小花盾葉薯蕷野生資源受到嚴(yán)重破壞。為了提高商品價(jià)值，該品種在云南省已形成規(guī)?；N植。但薯蕷常以營(yíng)養(yǎng)繁殖方式連續(xù)多年進(jìn)行栽培，薯蕷病害發(fā)生嚴(yán)重，尤其以病毒病的發(fā)生更為明顯［1］。

薯蕷褪綠壞死花葉病毒（yam chlorotic necrotic mosaic virus，YCNMV）是近年來(lái)從云南小花盾葉薯蕷分離到的一個(gè)新病毒，屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）柘橙病毒屬（Macluravirus）成員［2，3］。目前，柘橙病毒屬共收錄有7個(gè)病毒，其中6個(gè)確定種，1個(gè)暫定種，YCNMV被國(guó)際病毒命名委員會(huì)（ICTV）確定為該病毒屬的暫定成員［3］。

國(guó)際上檢測(cè)植物病毒主要從病毒生物學(xué)特征（例如，病毒顆粒形態(tài)、長(zhǎng)度、宿主范圍及感病植株癥狀等）、血清學(xué)以及分子生物學(xué)角度進(jìn)行鑒別［4］。但薯蕷樣品常存在著復(fù)合侵染情況［5］，單純從植物病征難以進(jìn)行準(zhǔn)確有效的判斷；同時(shí)，薯蕷葉片含有大量的皂苷、多糖等物質(zhì)，對(duì)RNA的提取技術(shù)及成本要求較高，為該病毒的檢測(cè)帶來(lái)很多困難。因此，為了能快速有效的檢測(cè)該病毒及進(jìn)一步確定該病毒的分類學(xué)地位，本實(shí)驗(yàn)克隆YCNMV病毒的CP基因，并通過(guò)基因工程的方法構(gòu)建原核表達(dá)載體，獲得該病毒的CP融合蛋白，經(jīng)免疫注射新西蘭白兔制備抗血清，旨在建立起相對(duì)敏感、特異、可靠的血清學(xué)檢測(cè)體系，為該病毒的檢測(cè)提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用毒源由本實(shí)驗(yàn)室采自云南永勝縣，并保存于實(shí)驗(yàn)室無(wú)蟲溫室大棚內(nèi)由專人負(fù)責(zé)管理與維護(hù)。pET-30a原核表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存于-80℃冰箱；DH5α菌株、BL21（DE3）菌株、r Taq酶、Easysee Western Marker等購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Eco R V、Hin d III內(nèi)切酶以及T4連接酶等購(gòu)自Fermentas公司；DL5000 Marker、質(zhì)粒抽提試劑盒、膠純化回收試劑盒、M-MLV Reverse Transcriptase、Ribonuclease Inhibitor、IPTG、pMD19-T simple克隆載體及X-Gal、LA Taq DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司；40%丙烯酰胺購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司；羊抗兔IgG購(gòu)自ABcam；Tris-base、EDTA-Na2+、甘油、Tryptone、Yeast extract及透析袋等其他常用試劑均購(gòu)自Sigma公司；Ni-NTA+Agarose親和純化柱購(gòu)自QIAGEN公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司及Invitrogen上海合成部進(jìn)行合成；菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.2 方法

1.2.1 薯蕷總RNA的提取及cDNA的合成 薯蕷總RNA按照RNeasy Plant mini（QIAGEN公司）試劑盒所述方法提取，以NanoDrop檢測(cè)OD260/280并在1.5%濃度的變性瓊脂糖凝膠電泳以確定提取RNA的質(zhì)量，符合標(biāo)準(zhǔn)的樣品于-80℃凍存?zhèn)溆?。以M4T（5'-GTTTTCCCAGTCACGAC（T）15-3'）引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，共兩步。反轉(zhuǎn)錄第一步體系如下：1 μL M4T引物；5 μL模板RNA（185 ng/μL）；共計(jì)6 μL反應(yīng)液于70℃孵育10 min后冰浴急冷2 min。第二步體系如下：6 μL第一步反應(yīng)液；2 μL 5×M-MLV Buffer；0.5 μL dNTP Mixture（10 mmol/L each）；0.25 μL RNase Inhibitor（40 U/μL）；0.5 μL M-MLV反 轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL）；0.75 μL RNase free ddH2O，以上共計(jì)10 μL反應(yīng)液，于42℃反應(yīng)1 h，70℃反應(yīng)15 min，反應(yīng)產(chǎn)物于-80℃冰箱凍存。

1.2.2 pET30a-CP原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)前期工作中以Sprimer/M4引物對(duì)［6］擴(kuò)增獲得的YCNMV病毒3'端序列（數(shù)據(jù)未提供），由上海捷瑞生物工程公司合成如下引物：CP-F：5'-GCAGATATCATGG ATCTTACAGCGCCAG-3'；CP-R：5'-GCAAAGCTTTTA ATATAAGGCTGGACGC-3'（下劃線部分分別為Eco R V及Hin d III酶切位點(diǎn)）。以稀釋10倍后的cDNA為模板，采用TaKaRa公司LA Taq DNA聚合酶按照使用說(shuō)明書上所述體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%（W/V）瓊脂糖凝膠100 V電泳60 min分離后，以TaKaRa公司膠純化回收試劑盒精確切取目的條帶回收，具體操作參照試劑盒所述步驟進(jìn)行。純化產(chǎn)物與pMD19-T simple按照說(shuō)明書所述比例于16℃過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選及菌液PCR進(jìn)行初步驗(yàn)證后，提取陽(yáng)性單克隆質(zhì)粒送南京金斯瑞公司測(cè)序以驗(yàn)證質(zhì)粒序列。將驗(yàn)證序列無(wú)誤的質(zhì)粒及pET-30a空載體以Eco R V及Hin d III按說(shuō)明書所述體系分別進(jìn)行雙酶切后純化回收目的片段與酶切后的pET30a載體，T4連接酶進(jìn)行連接后，將pET30a-CP載體轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，再經(jīng)過(guò)菌液PCR及pET30a-CP質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤后，獲得含有pET30a-CP載體的表達(dá)菌株。

1.2.3 CP基因的誘導(dǎo)表達(dá)體系的優(yōu)化及蛋白純化轉(zhuǎn)化后的表達(dá)菌先以不同濃度IPTG、不同誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行誘導(dǎo)以摸索最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件并對(duì)該融合蛋白的溶解性進(jìn)行分析。最終誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)10% SDSPAGE電泳后，以考馬斯亮藍(lán)G-250染色檢測(cè)結(jié)果。誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白使用Ni+-NTA Agarose親和純化柱進(jìn)行純化后，分別以70、100、200和300 mmol/L咪唑梯度洗脫，確定最佳洗脫條件。洗脫蛋白以透析袋和PBS緩沖液（pH7.4）進(jìn)行透析，透析蛋白經(jīng)NanoDrop檢測(cè)濃度及質(zhì)量后凍存于-80℃冰箱。

1.2.4 抗血清的制備、效價(jià)檢測(cè)及Western blotting檢測(cè) 純化后的蛋白經(jīng)過(guò)定量檢測(cè)后，免疫2只新西蘭白兔（2-2.5 kg），每2-3周進(jìn)行一次皮下免疫（免疫抗原400 μg/次），共免疫4次，待效價(jià)大于1∶50 000時(shí)進(jìn)行采血制備抗血清，凍存于-80℃冰箱備用。獲得的抗血清以ABcam公司的羊抗兔-HRP作為二抗，以ID-ELISA檢測(cè)其效價(jià)（效價(jià)=樣品OD/空白OD≥2.1，即P/N≥2.1時(shí)的最高稀釋度，包被抗原濃度5 μg/mL，100 μL/孔），并通過(guò)Western blotting檢測(cè)其與抗原蛋白結(jié)合的特異性情況［7］。

1.2.5 樣品植株的ID-ELISA檢測(cè) 將樣品葉片以1∶10 000（W/V）的比例，以包被緩沖液PBST進(jìn)行稀釋后，研磨，經(jīng)短暫離心后取上清100 μL/孔加入到酶標(biāo)板中，以制備的兔抗作為一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行ID-ELISA檢測(cè)，最后以TMB顯色并測(cè)定OD值，計(jì)算P/N。

2 結(jié)果

2.1 YCNMV CP基因的克隆及原核表達(dá)載體的構(gòu)建以RNeasy Plant mini（QIAGEN）試劑盒可獲得高質(zhì)量的總RNA（圖1），可以用于后續(xù)試驗(yàn)。以設(shè)計(jì)的CP基因特異引物CP-F及CP-R可擴(kuò)增到800 bp左右的特異性條帶，該條帶與預(yù)期大小相符（圖2）。將該條帶切膠純化并插入到pMD19-T simple克隆載體中，測(cè)序結(jié)果表明，該分離物CP基因核苷酸序列為867 nt，序列能通讀，能正確翻譯氨基酸序列，連接在載體中的CP基因序列與預(yù)測(cè)的CP基因核苷酸和氨基酸序列同源性均為99.65%（圖3和圖4），即獲得的CP基因序列與預(yù)期序列基本一致。該克隆載體經(jīng)雙酶切后，將CP基因插入到pET-30a原核表達(dá)載體，測(cè)序結(jié)果表明，核苷酸序列與之前測(cè)定序列一致。說(shuō)明已成功構(gòu)建了YCNMV-CP基因的原核表達(dá)載體。

圖1 薯蕷總RNA樣品瓊脂糖凝膠電泳

圖2 CP基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.2 YCNMV CP基因的原核表達(dá)及蛋白純化

將成功構(gòu)建的pET30a-CP原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21（DE3）菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，初步確立誘導(dǎo)表達(dá)體系為0.8 mmol/L IPTG，以28℃誘導(dǎo)6 h，同時(shí)分析融合蛋白的溶解性。SDS-PAGE結(jié)果（圖5）表明，表達(dá)的融合蛋白多數(shù)以包涵體的形式集中在沉淀部分，而上清中僅存在相對(duì)較少的表達(dá)蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)離心后，上清液中的融合蛋白經(jīng)Ni+-NTA親和層析柱純化后，以PBS緩沖液（pH7.4）進(jìn)行透析，以NanoDrop檢測(cè)，單次純化蛋白濃度為0.192-0.231 mg/mL。

圖3 連接到pMD19-T Simp le上的CP核苷酸序列與模板序列比對(duì)結(jié)果

2.3 抗血清效價(jià)檢測(cè)及Westernblotting檢測(cè)

制備的抗血清通過(guò)ID-ELISA檢測(cè)效價(jià)，結(jié)果表明該抗血清在稀釋1∶256 000時(shí)，P/N=2.2，表明該抗血清效價(jià)為1∶256 000，可以用于后續(xù)檢測(cè)（表1）。Western blotting（圖6）分析表明，制備的抗體僅與抗原蛋白產(chǎn)生特異條帶，而免疫前血清（CK-）在相同位置無(wú)條帶。

圖4 載體中CP蛋白與模板CP蛋白氨基酸序列比對(duì)

圖5 純化蛋白溶解度及純度的SDS-PAGE電泳分析

表1 ID-ELISA抗血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果

圖6 CP蛋白抗血清的W estern blotting檢測(cè)

2.4 不同地區(qū)薯蕷病葉樣品的ID-ELISA檢測(cè)

以制備的抗血清對(duì)采自云南省境內(nèi)麗江、鶴慶、維西、映華、祿豐及永勝等地共計(jì)101個(gè)表現(xiàn)出褪綠、壞死等癥狀的薯蕷病葉樣品研磨液進(jìn)行ID-ELISA檢測(cè)（圖7）并測(cè)定其吸光度值。檢測(cè)出映華（6株）、祿豐（2株）及永勝（5株）等3地共計(jì)13個(gè)樣品ID-ELISA結(jié)果顯示為陽(yáng)性（P/N≥2.1）。篩選出的陽(yáng)性樣品經(jīng)電鏡及RT-PCR檢測(cè)后證實(shí)該樣品內(nèi)確實(shí)含有YCNMV病毒。

3 討論

薯蕷褪綠壞死花葉病毒（YCNMV）是近年來(lái)在小花盾葉薯蕷中新發(fā)現(xiàn)的柘橙病毒屬病毒，屬于馬鈴薯Y病毒科。目前僅見(jiàn)該病毒侵染薯蕷，尚未發(fā)現(xiàn)該病毒侵染其他物種的報(bào)道，鮮見(jiàn)與該病毒相關(guān)的其他研究報(bào)道。薯蕷是我國(guó)一種重要的藥材，同時(shí)也是深受群眾喜愛(ài)的一種食材。因此近年來(lái)在云南省大理、祿豐等多地已經(jīng)形成規(guī)?；N植。但由于薯蕷是多年生草本纏繞植物，常采用無(wú)性繁殖的方式年復(fù)一年地進(jìn)行種植，這為該型病毒的繁殖、擴(kuò)散提供了良好的條件，同時(shí)也對(duì)薯蕷的品質(zhì)與產(chǎn)量帶來(lái)了不利影響。因此，構(gòu)建針對(duì)該型病毒穩(wěn)定、可靠的血清學(xué)檢測(cè)體系對(duì)后續(xù)檢測(cè)、研發(fā)、抗病等工作極為重要。

圖7 不同地區(qū)樣品的ID-ELISA檢測(cè)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)以RT-PCR及克隆的方法，構(gòu)建了含有YCNMV CP基因的原核表達(dá)載體。通過(guò)對(duì)該型病毒CP基因進(jìn)行的序列比對(duì)及分析發(fā)現(xiàn)，該型病毒分離物僅在CP蛋白N端第17-19位氨基酸殘基中存在與其親緣關(guān)系較近的Chinese yam necrotic mosaic virus（CYNMV）中的“DKG”結(jié)構(gòu)域相似的“SKG”結(jié)構(gòu)域［8］，該結(jié)構(gòu)域是否也與先前報(bào)道的存在于馬鈴薯Y病毒科中高度保守的“DAG”行使相同或相似功能尚不得而知。其他保守序列，如“NGTS”（140-143 aa）及“AFDF”（217-220 aa）［9］均在該型病毒CP蛋白中出現(xiàn)。

外源基因在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行原核表達(dá)時(shí)，由于多種因素的存在，如短時(shí)間內(nèi)形成高濃度多肽，導(dǎo)致蛋白無(wú)法正確折疊等，極易使表達(dá)的蛋白形成包涵體并沉淀［10］。這對(duì)后續(xù)的蛋白純化工作造成了很大影響，導(dǎo)致單次純化的蛋白量大大減少。通過(guò)對(duì)表達(dá)蛋白的溶解狀態(tài)分析，以及不同誘導(dǎo)表達(dá)體系的摸索，實(shí)驗(yàn)確立了優(yōu)化后以較低溫度（28℃）、較長(zhǎng)時(shí)間（6 h）及較高濃度IPTG（0.8 mmol/L）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的體系，促進(jìn)了CP融合蛋白在大腸桿菌內(nèi)的可溶性表達(dá)。

在抗血清的制備方面，目前，通過(guò)電鏡負(fù)染觀察已發(fā)現(xiàn)球狀、桿狀、線狀等多種不同類型病毒復(fù)合侵染同一株小花盾葉薯蕷的情況（數(shù)據(jù)未提供），且對(duì)于含有大量多糖多酚類物質(zhì)的植株來(lái)說(shuō)很難提純病毒［11，12］。因此，以純化病毒粒子來(lái)制備抗血清的傳統(tǒng)方案并不適用。目前，已有諸多通過(guò)表達(dá)病毒CP基因融合蛋白免疫動(dòng)物以制備抗血清的研究報(bào)道［13-17］證明，該方法可靠、有效。本研究通過(guò)進(jìn)行RT-PCR、構(gòu)建原核表達(dá)載體、誘導(dǎo)pET30a-CP融合蛋白的表達(dá)及純化、制備抗血清、后續(xù)檢測(cè)篩選等相關(guān)工作，成功制備出可用于檢測(cè)YCNMV的抗血清并應(yīng)用到樣品篩查中，為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體的方法獲得了能夠正確表達(dá)YCNMV CP基因的大腸桿菌表達(dá)菌株。該表達(dá)菌表達(dá)的融合蛋白經(jīng)純化后免疫新西蘭大白兔，制備效價(jià)較高的抗血清，檢測(cè)表明該抗血清可以有效地檢測(cè)到病樣中的YCNMV病毒，初步建立起了可用于檢測(cè)YCNMV的ELISA檢測(cè)體系。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Prokaryotic Expression of CP Gene of Yam Chlorotic Necrotic M osaic Virus and Preparation of Its Antiserum

Zhang Pengyuan Ren Longhui Wang Jianguang Chen Zhuangzhuang Zhong Yu Chen Suiyun
（School of Life Science，Yunnan University，Kunming650091）

Yam chlorotic necrotic mosaic virus（YCNMV）is a new tentative species of genus Macluravirus in the family Potyviridae. Referring to the 3'-terminal sequence amplified with degenerate primers Sprimer/M4 by RT-PCR， we designed the specific primer pair of CP gene of YCNMV. The PCR product of CP gene was inserted into the pET30a prokaryotic expression vector， which was subsequently expressed in BL21（DE）strain by induction. Fusion protein was purified with Ni+-NTA affinity column and was used to immunize New Zealand white rabbits to produce the antiserum. Results showed that the CP gene ligated in the prokaryotic expression vector shared 99.65% homology with the template CP gene in both nucleotide and protein sequence. SDS-PAGE results indicated that the CP fusion protein was about 44 kD in size， which was in accord with the prediction. The antiserum was tested by both ID-ELISA method and Western blotting， which showed that the polyclonal antibody had a relatively high level of titer， and reliably， sensitively and specifically bound with the YCNMV virus particles. These results indicate that the antiserum is suitable for YCNMV detection.

yam chlorotic necrotic mosaic virus；coat protein；prokaryotic expression；antiserum

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.030

2014-11-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31101416），云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院科學(xué)研究與人才培養(yǎng)開放基金項(xiàng)目（2013S205），云南省煙草公司項(xiàng)目（2011YN60，2012YN10，2012YN36，2012YN13）

張鵬遠(yuǎn)，男，博士研究生，研究方向：植物病毒及分子生物學(xué)；E-mail：acception@yeah.net

王建光，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：植物病毒學(xué)；E-mail：jgwangyn@yeah.net