陳新，孫維礦，趙玲，劉梁

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023）

米糠多糖理化性質(zhì)研究

陳新，孫維礦，趙玲，劉梁*

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023）

通過Molish、Benidick、I-KI等顏色反應(yīng)研究米糠多糖的理化性質(zhì)，并運(yùn)用NMR、HPLC、IR等現(xiàn)代分析手段對米糠多糖的單糖組成、分子量分布、理化性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明米糠多糖中葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖的摩爾比為1.669∶1∶0.225∶1.228，分子量在4.878×105（±0.506%）范圍的多糖含量為70.8%，分子量在9.802×104（±3.368%）范圍的多糖含量為29.2%。

米糠多糖；理化性質(zhì)；糖組成；分子量分布

稻米加工中，糙米皮層被碾除得到精白米，同時得到副產(chǎn)物米糠（即被碾下的籽粒的表皮、部分糊粉層、米胚芽和少量破碎胚乳的混合物）［1-2］。米糠重量雖然不足糙米的10%，但糙米中約2/3的營養(yǎng)素存在米糠中，因此，米糠是一種具有很大潛力的優(yōu)質(zhì)食品原料［3-4］。米糠多糖存在于稻谷穎果皮層里，是目前尚未被深入開發(fā)和廣泛應(yīng)用的主要營養(yǎng)成分之一［5-6］。采用不同的提取工藝可以得到多種米糠多糖，它們都具有顯著的生物活性和保健功能，不僅具有一般多糖或膳食纖維所具有的生理功能，而且還具有抗腫瘤、降血糖、降膽固醇和增強(qiáng)免疫等多種生物活性［7-9］。本實(shí)驗(yàn)室從米糠中提取、純化得到米糠多糖，并對其理化性質(zhì)、單糖組成、分子量分布等參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)分析和測試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果對米糠的深加工和米糠多糖類產(chǎn)品的研究和開發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

米糠多糖（本實(shí)驗(yàn)室從米糠中分離純化所得）；乙醇、丙酮，乙醚、正丁醇、異丙醇、α-萘酚、苯酚、硫酸、檸檬酸鈉、無水碳酸鈉、結(jié)晶硫酸銅、碘、碘化鉀、茚三酮、咔唑、三氟乙酸、溴化鉀（均為AR）；葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸（均為BR）。

1.2 儀器和設(shè)備

安捷倫1026型高效液相色譜儀；NEXUS-670型傅里葉紅外光譜儀（美國NICOLET公司生產(chǎn)）；Bruker AV400型雙通道全數(shù)字化傅里葉超導(dǎo)核磁共振譜儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多糖的理化性質(zhì)

稱取25 mg米糠多糖，溶解于超純水中，定溶于25 mL容量瓶中，得1.0 mg/mL的米糠多糖溶液，待用。

1）溶解性試驗(yàn)：將多糖溶于冷水、熱水、乙酸乙酯、乙醇、丙酮，乙醚、正丁醇、異丙醇中，觀察其溶解情況。

2）α-萘酚試驗(yàn)（Molish反應(yīng)）：往試管中加入1 mL 1.0 mg/mL的米糠多糖水溶液，滴入2滴10%的α-萘酚乙醇溶液，混合均勻后將試管傾斜，沿管壁慢慢加入1 mL濃硫酸（勿搖動）。豎直后仔細(xì)觀察兩層液面交界處顏色變化，若在兩層交界處出現(xiàn)紫紅色的環(huán)，表明樣品中含有糖類化合物。

3）苯酚-硫酸試驗(yàn)：往試管中加入1.0 mL 1.0 mg/mL的米糠多糖樣品水溶液，加入1.0 mL 6%的苯酚溶液，搖勻，并迅速滴加5 mL濃硫酸，靜置10 min，振蕩搖勻，觀察溶液顏色變化。

4）Benedict試驗(yàn)：Benedict試劑的配制，將85 g檸檬酸鈉和50 g無水碳酸鈉溶于400 mL水中，另將8.5 g結(jié)晶硫酸銅溶于50 mL水中，將硫酸銅溶液注入檸檬酸鈉溶液中，如溶液不澄清，可過濾去除不溶物。

鑒定操作：往試管中加入1 mL Benedict試劑和0.5 mL 1.0 mg/mL的米糠多糖水溶液，在沸水浴中加熱3 min～5 min，冷卻至室溫，若有紅色或黃色沉淀生成，表明樣品中含有還原性糖。

5）碘反應(yīng)：將提取多糖樣品配成1 mg/mL的溶液，用淀粉配成1.0 mg/mL作陽性對照，看是否會變藍(lán)色。

6）I-KI反應(yīng)：用吸管吸取5滴1.0 mg/mL的米糠多糖樣品水溶液于點(diǎn)滴板小孔內(nèi)，加2滴I-KI溶液（IKI溶液配制方法：碘化鉀3 g；蒸餾水100 mL；碘1 g。先將碘化鉀溶于超純水中，待全部溶解后再加碘，振蕩溶解）以蒸餾水和淀粉溶液作對照。觀察顏色變化。

7）茚三酮反應(yīng)：分別取1 mL濃度為1 mg/mL的多糖樣品溶液，加入0.5 mL的0.1%茚三酮乙醇溶液，震蕩搖勻，煮沸5 min，冷卻，觀察顏色變化。以蒸餾水作陰性對照，0.5%氨基酸作為陽性對照。

8）硫酸-咔唑反應(yīng)：取1 mL濃度為1 mg/mL的多糖樣品加入濃硫酸5.0 mL，邊加邊流水冷卻，冷至室溫后加入0.15%的咔唑無水乙醇溶液0.20 mL，搖勻，再置沸水浴中加熱15 min，觀察顏色變化，若有紫色生成，說明多糖樣品中含有糖醛酸。

1.3.2 米糠多糖單糖組成的HPLC分析

1.3.2.1 供試品溶液的配制

稱取米糠多糖12.5 mg，溶于5 mL 4 mol/L三氟乙酸溶液中，N2封管，100℃水解4 h，減壓旋轉(zhuǎn)濃縮蒸干。用水溶解并定溶于10 mL容量瓶中，0.45 μm濾膜過濾，取濾液20 μL進(jìn)樣。

1.3.2.2 對照品溶液的制備

稱取葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸7種單糖各10 mg，分別用水溶解并定容于10 mL容量瓶中，即得濃度分別為1.0 mg/mL的各單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。0.45 μm濾膜過濾，取濾液20 μL進(jìn)樣。

分別稱取葡萄糖、阿拉伯糖、木糖及半乳糖12.5 mg，混合后用水溶解并定容于50 mL容量瓶中，作為對照品母液。分別從對照品母液中準(zhǔn)確移取0.75、1.5、3.0、6.0、7.5、18.75 mL至25mL容量瓶中，配制出濃度分別為30.0、60.0、120.0、240、300、750 μg/mL的對照品溶液。0.45 μm濾膜過濾，取濾液20 μL進(jìn)樣。

1.3.2.3 色譜條件

高效液相色譜儀（備有Varian Prostar 210高壓泵，7725Ⅰ型手動進(jìn)樣器，Varian Prostar 500柱溫箱，SEDEX 90 LT-ELSD低溫型蒸發(fā)光散射檢測器），色譜柱型號為sugar sp0810 300 mm×8 mm，7 μm，流動相為超純水（用前經(jīng)0.45 μm濾膜過濾），柱溫箱溫度為25℃，流速為1.0 mL/min。米糠多糖及對照品檢測時間均為20 min。

1.3.3 米糠多糖分子量的測定

激光光散射法測定多糖分子量原理：激光照射到多糖樣品時，會在各個方向產(chǎn)生散射光。SEDEX 90 LT-ELSD低溫型蒸發(fā)光散射檢測器可在18個角度對散射光進(jìn)行檢測，收集散射光的強(qiáng)度。散射光強(qiáng)度與分子量和溶液濃度成正比。散射光角度的變化與分子的尺寸大小有關(guān)。高分子溶液的激光散射可基本表示。

式中：K為與溶劑性質(zhì)和入射光頻率相關(guān)的常數(shù)；c為溶液濃度；R（θ）為不同角度去除溶劑影響后的散射光強(qiáng)度；θ為散射光角度；MW為平均分子量；P（θ）為散射光強(qiáng)度隨角度變化的函數(shù)；A2為第二維里系數(shù)，是溶劑與溶質(zhì)相互作用的度量，一般溶液極稀時可忽略；n0為溶劑的折射率；dn/dc為折光指數(shù)增量，即溶液折射率與濃度變化的比值；N為阿伏加德羅常數(shù)；λ為入射光波長；Rg為高分子均方末端距，即鏈質(zhì)量中心至各個鏈段距離平方的平均值。

R（θ）為儀器測定量，K、c、n0、dn/dc、N、λ、θ均為常數(shù)或已知量，只有MW、Rg2和A23個高分子鏈的基本參數(shù)為未知值，通過多個角度光散射強(qiáng)度的測定，即可推導(dǎo)求出。

應(yīng)對保健食品、嬰幼兒配方食品、特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品等特殊食品進(jìn)行專柜或?qū)^(qū)銷售，并設(shè)立明顯的設(shè)立提示牌，注明“****銷售專區(qū)（或?qū)９瘢弊謽印?/p>

1.3.4 核磁共振測定

多糖樣品用D2O配成濃度為25 mg/mL的樣品溶液，室溫下利用Bruker AV400超導(dǎo)核磁共振譜儀進(jìn)行測試分析。

2結(jié)果與討論

2.1 米糠多糖的理化性質(zhì)

米糠多糖冷凍干燥后為白色絮狀固體，極易溶于熱水，不溶于乙酸乙酯、乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇等有機(jī)溶劑，水溶液為無色澄清液體。α-萘酚反應(yīng)呈陽性；硫酸-苯酚反應(yīng)亦呈陽性；Benedict試驗(yàn)、碘反應(yīng)、碘-碘化鉀反應(yīng)、硫酸-咔唑反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)均呈陰性。表明樣品含有多糖，不含還原糖、糖醛酸、淀粉及氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)。

2.2 米糠多糖的單糖組成

米糠多糖的液相色譜圖如圖2所示，對照品液相色譜圖如圖1所示。

圖1 對照品的液相色譜圖（溶液濃度為0.75 mg/mL）Fig.1The HPLC spectrum of the control（The concentration of the solution was 0.75 mg/mL）

圖2 米糠多糖的液相色譜圖（溶液濃度為1.25 mg/mL）Fig.2The HPLC spectrum of rice bran polysaccharide（The concentration of the solution was 1.25 mg/mL）

通過比較可知，米糠多糖樣品液相色譜圖中的葡萄糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖的出峰時間與對照品色譜圖一致，以對照品中各單糖濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出米糠多糖中葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖的摩爾比為1.669∶1∶0.225∶1.228。

2.3 米糠多糖分子量測定

樣品溶液平行進(jìn)樣3次，正確記錄樣品保留時間及色譜圖，按已知折光儀校正常數(shù)和質(zhì)量回收率設(shè)為100%數(shù)據(jù)處理法計(jì)算樣品分子量及其分子量分布，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3和表1所示。

圖3 米糠多糖分子量測定液相色譜圖Fig.3The HPLC spectrum of rice bran polysaccharide for molecular weight detected

表1 米糠多糖的分子量分布Table 1The molecular weight distribution of rice bran polysaccharide

2.4 米糠多糖紅外光譜分析

紅外光譜法是研究有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)的一種重要方法，也是研究糖類化合物結(jié)構(gòu)不可或缺的手段，通過分析各種糖的特征吸收，可以檢測糖環(huán)的構(gòu)象和糖苷鍵的構(gòu)型。由于糖分子中的官能團(tuán)主要為羥基和碳?xì)滏I，因此，整個光譜的吸收峰較少，而且大多寬而鈍，這是由于形成氫鍵所致。

米糠多糖的紅外光譜圖如圖4所示。

圖4米糠多糖的紅外吸收光譜Fig.4IR spectrum of rice bran polysaccharide

圖4 可看到，3 385 cm-1出現(xiàn)的寬峰是糖分子內(nèi)或分子間氫鍵O-H伸縮振動的表現(xiàn)；2 973 cm-1和1 411 cm-1處的吸收峰為C-H伸縮振動和變角振動引起的；以上吸收峰構(gòu)成了多糖的特征吸收峰。1642 cm-1處為-CHO的C=O伸縮振動峰，1 077 cm-1是C-O振動引起的，這也與前面測定結(jié)果相一致，860 cm-1出現(xiàn)的吸收峰表明樣品中有α-糖苷鍵存在。

2.5 米糠多糖核磁共振分析

核磁共振（NMR）對于多糖的結(jié)構(gòu)鑒定起到非常重要的作用。如糖類的化學(xué)組成，糖苷鍵的構(gòu)型，糖環(huán)的構(gòu)象，糖殘基的排列順序，糖苷鍵的鍵合位置等。NMR檢測組成有機(jī)化合物分子的原子核性質(zhì)及其與周圍化學(xué)環(huán)境的相互作用，一維核磁共振氫譜（1HNMR）為多糖的結(jié)構(gòu)分析提供很多有用的信息。米糠多糖的1H-NMR如圖5所示。

從圖5中可以看出δH5.209左右為異頭氫，由譜圖可以看出異頭氫的峰主要有一種；δH4.613為溶劑峰；δH4.091～3.273之間有較多的氫峰，主要是與O相連的氫峰；δH2.035～1.720間的峰主要為-CH2的氫峰。由此可判斷樣品不含蛋白質(zhì)。

圖5 米糠多糖核磁共振譜圖Fig.5HNMR spectrum of rice bran polysaccharide

3結(jié)論

運(yùn)用各種物理、化學(xué)分析鑒別手段對米糠多糖的理化性質(zhì)進(jìn)行研究。米糠多糖易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑，同時不含還原糖、糖醛酸、淀粉及氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。米糠多糖主要由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖及半乳糖四種單糖組成，且葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖的摩爾比為1.669∶1∶0.225∶1.228。米糠多糖分子量在4.878×105（±0.506%）范圍的多糖含量為70.8%，分子量在9.802×104（±3.368%）范圍的多糖含量為29.2%。

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The Study on the Physicochemical Property of Rice Bran Polysaccharide

CHEN Xin，SUN Wei-kuang，ZHAO Ling，LIU Liang*
（School of Biological and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China）

The physicochemical property of rice bran polysaccharide was studied by Molish、Benidick、I-KI color test，and he composition，molecular weight distribution were identified by NMR、HPLC、IR analysis methods.The results showed that the sugar molar composition ratio of glucose，xylose，galactose，arabia in rice bran polysaccharide was 1.669∶1∶0.225∶1.228，and the polysaccharide molecular weight distribution of was 70.8%in 4.878×105（±0.506%），29.2%in 9.802×104（±3.368%）.

rice bran polysaccharide；physicochemical property；composition；molecular weigh distribution

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.09.005

2015-01-27

國家糧食公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201313002）

陳新（1978—），男（漢），副教授，博士，研究方向：食品活性物質(zhì)研究與開發(fā)。

*通信作者：劉梁（1981—），男（漢），講師，博士，研究方向：食品功能因子研究。