王　銳　宋征宇　于永強(qiáng)　楊婕琳

·論著·

E-鈣黏蛋白和VEGF在胃黏膜的表達(dá)及其相關(guān)性分析

王銳宋征宇于永強(qiáng)楊婕琳

目的通過分析E-cadherin和VEGF在慢性胃炎、腸上皮化生、非典型增生及胃癌中表達(dá)變化的趨勢，探討二者在幾種胃黏膜病變表達(dá)的相關(guān)性。方法用免疫組織化學(xué)法檢測E-cadherin和VEGF在慢性胃炎組、腸上皮化生組、非典型增生及胃癌中的表達(dá)情況，胃黏膜非癌組織中的表達(dá)分別與胃癌組比較，并分析二者相關(guān)性。結(jié)果在慢性胃炎、腸上皮化生、非典型增生中VEGF表達(dá)的陽性率呈逐漸上升趨勢，而E-cadherin的表達(dá)逐漸下調(diào)，分別與胃癌組作對照分析，表達(dá)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。相關(guān)性比較提示二者表達(dá)存在負(fù)相關(guān)。結(jié)論E-cadherin與VEGF的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，二者均參與胃黏膜逐漸演變過程，對于E-cadherin和VEGF表達(dá)異常的胃黏膜腸上皮化生或非典型增生患者，兩者的聯(lián)合監(jiān)測對胃癌癌前病變的診治有一定的參考意義。

E-鈣黏蛋白；血管內(nèi)皮生長因子；胃腫瘤；癌前病變

腫瘤是危害人類健康的重要疾病，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤導(dǎo)致死亡的主要原因之一。很多上皮來源的腫瘤在不同程度上其細(xì)胞上皮間轉(zhuǎn)化被不適當(dāng)?shù)募せ罨蚱茐?，通過細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的改變及相互作用，使其易于脫離原發(fā)部位，從而具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)是細(xì)胞上皮間轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志［1］，具有細(xì)胞與細(xì)胞間相互黏附、維持組織結(jié)構(gòu)完整性和極性的作用。血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）可對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有強(qiáng)烈的促分裂和趨化作用，同時(shí)促進(jìn)血管內(nèi)物質(zhì)滲出，為血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供基質(zhì)。目前在胃黏膜非癌組織中E-cadherin和VEGF的相關(guān)性報(bào)道較少，本文旨在探討胃黏膜不同狀態(tài)下二者的關(guān)系。對腸上皮化生、非典型增生的發(fā)生、發(fā)展及分子標(biāo)志物進(jìn)行初步探索，從而為降低胃癌發(fā)病率及早期發(fā)現(xiàn)胃癌提供依據(jù)。

對象與方法

一、一般資料

選取河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院門診胃鏡室2012年12月至2013年12月行胃鏡檢查患者220例，男性118例、女性102例，年齡28～81歲（平均年齡60.6歲）。其中慢性胃炎組40例，腸上皮化生組60例，非典型增生組60例，胃癌組60例，且胃癌患者均為首次發(fā)現(xiàn)，術(shù)前未經(jīng)過手術(shù)、放化療或免疫治療等。

二、方法

應(yīng)用免疫組化進(jìn)行檢測，所采用試劑鼠抗人E-cadherin單克隆抗體、VEGF單克隆抗體，二抗染色試劑盒，枸櫞酸抗原修復(fù)液、DAB顯色液及PBS等均購于北京中杉金橋生物有限公司。經(jīng)常規(guī)脫蠟、修復(fù)、過氧化氫（H2O2）封閉后滴加一抗，VEGF（1：100），E-cadherin（1：50），4℃過夜，滴加二抗試劑37℃孵育15 min，最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。

三、結(jié)果判斷

所有指標(biāo)的結(jié)果均由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師經(jīng)雙盲法判定。E-cadherin主要位于細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞漿，VEGF主要位于細(xì)胞漿，免疫組化陽性反應(yīng)為黃-棕褐色顆粒。陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)算方法為：每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)100個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，取均值，以百分?jǐn)?shù)表示細(xì)胞陽性指數(shù)。染色強(qiáng)度：無染色為0分；淺黃色為1分；黃色為2分；棕黃或棕褐色為3分。陽性細(xì)胞百分率：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞數(shù)＜25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分率之和：0分為（-），1～2分為（＋），3～4分為（＋＋），5～7分為（＋＋＋）。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

分析所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料組間率的比較用采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié)果

一、E-cadherin和VEGF在幾種不同胃黏膜病理狀態(tài)中的表達(dá)（見表1）

表1　E-cadherin和VEGF在胃黏膜不同病理狀態(tài)的表達(dá)變化

E-cadherin在慢性胃炎、腸上皮化生、非典型增生、胃癌組中表達(dá)呈逐漸下調(diào)，陽性率分別為82.5%、61.7%、51.7%、21.7%。與胃癌作對照比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05（見圖1）。慢性胃炎、腸上皮化生、非典型增生、胃癌組中VEGF表達(dá)隨著病變發(fā)展呈上升趨勢，陽性率分別為7.5%、65.0%、73.3%、88.3%。與胃癌作對照比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05（見圖2）。

二、E-cadherin和VEGF在癌前病變和胃癌中的表達(dá)

分別將腸上皮化生、非典型增生、胃癌組中E-cadherin和VEGF表達(dá)情況進(jìn)行相關(guān)性分析，在三組中二者表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)，見表2。

表2　E-cadherin和VEGF表達(dá)的相關(guān)性

討論

內(nèi)皮細(xì)胞形成一個(gè)選擇性的半透膜，控制血管和組織之間的細(xì)胞信號雙向傳送。這個(gè)功能需要通過上皮型鈣粘蛋白（E-cadherin）調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞-細(xì)胞連接的動(dòng)態(tài)平衡來完成。E-cadherin是一類介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間相互黏附、具有維持組織結(jié)構(gòu)完整性和極性的鈣依賴性跨膜糖蛋白。E-cadherin表達(dá)缺失可導(dǎo)致細(xì)胞黏附、連接功能障礙，內(nèi)皮通透性增加。人類的多種疾病及疾病的病理狀態(tài)都不同程度上出現(xiàn)了通透性的改變，而引起了生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究者的高度興趣。研究發(fā)現(xiàn)敲除E-cadherin基因的小鼠，在3個(gè)月后出現(xiàn)胃黏膜系細(xì)胞增生，12個(gè)月后出現(xiàn)印戒樣細(xì)胞，其在形態(tài)學(xué)上類似印戒細(xì)胞癌；24個(gè)月或更久，未發(fā)生侵襲性胃腺癌，因此認(rèn)為E-鈣黏蛋白的喪失可能導(dǎo)致癌前期病變的胃黏膜，但不足以供其惡性轉(zhuǎn)化［2］。另一項(xiàng)研究表明［3］敲除E-cadherin和p53基因的免疫缺陷小鼠，出現(xiàn)了低分化腺癌和印戒細(xì)胞癌，間充質(zhì)標(biāo)記上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的高表達(dá)。目前研究表明E-cadherin表達(dá)缺失與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。進(jìn)一步的研究證實(shí)與胃癌的TNM分期、分化程度，侵襲性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的因素有密切關(guān)系，表達(dá)下調(diào)時(shí)往往提示預(yù)后不良［4］。我們研究提示：E-cadherin在胃黏膜慢性炎癥、腸上皮化生、非典型增生、胃癌中表達(dá)逐漸減少。同時(shí)Zullo A等［5］研究發(fā)現(xiàn)腸上皮化生的發(fā)生與E-cadherin表達(dá)下調(diào)相關(guān)。說明在胃黏膜癌前狀態(tài)中E-cadherin出現(xiàn)一定程度的表達(dá)異常。

圖1　E-cadherin免疫組化結(jié)果

圖2　VEGF免疫組化結(jié)果

血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），為單一基因編碼的同源二聚體糖蛋白，能直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞移動(dòng)、增殖及分裂，并增加微血管通透性。介導(dǎo)新生血管形成并誘導(dǎo)蛋白溶解酶的生成降解細(xì)胞外基質(zhì)。它是針對內(nèi)皮細(xì)胞特異性最高，促血管生長作用最強(qiáng)的有絲分裂原。李建波等［6］研究將癌前病變與胃癌組織中VEGF表達(dá)比較分析提示其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。成旭惠等［7］發(fā)現(xiàn)VEGF與胃癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)。我們在研究中發(fā)現(xiàn)：慢性胃炎中VEGF陽性細(xì)胞僅少量表達(dá)，但是隨著細(xì)胞病變程度的增加，VEGF表達(dá)有一定的上升趨勢，陽性率分別為7.5%、65.0%、73.3%、88.3%，與胃癌作對照比較P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢奦EGF參與了胃黏膜演變的過程。

為了探討E-cadherin和VEGF在胃黏膜表達(dá)的作用，本實(shí)驗(yàn)將二者進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，二者在胃黏膜中的表達(dá)具有負(fù)相關(guān)性，說明二者可能存在負(fù)性反饋調(diào)節(jié)作用。E-cadherin在胃黏膜慢性炎癥、腸上皮化生、非典型增生、胃癌中表達(dá)逐漸減少，而VEGF的表達(dá)呈逐漸上調(diào)趨勢。來源于有關(guān)E-cadherin和VEGF蛋白表達(dá)及調(diào)節(jié)通路的研究可支持以上結(jié)果。C armeliet等［8］發(fā)現(xiàn)敲除VE-鈣黏蛋白基因?qū)π∈笈咛ビ兄滤佬缘淖饔?，表現(xiàn)出嚴(yán)重的血管發(fā)育缺陷，主要是緣于影響了內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和VEGF（血管內(nèi)皮生長因子）信號表達(dá)。另一項(xiàng)研究表明［9］，E-cadherin的功能與VEGF-R2（血管內(nèi)皮生長因子受體2，也被稱為的Flk1）有密切相關(guān)。E-cadherin在靜止的內(nèi)皮細(xì)胞上有調(diào)節(jié)VEGFR2的抗凋亡作用。在血管生成的信號傳導(dǎo)途徑中內(nèi)皮細(xì)胞的可塑性，如細(xì)胞出芽，遷移，滲透性，均受E-鈣黏蛋白和VEGF-R2相互作用的調(diào)節(jié)。E-cadherin基因的表達(dá)下調(diào)是由多種因素影響而導(dǎo)致的，這些因素包括Snail、Slug、TGF-β、Twist等轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其中轉(zhuǎn)錄抑制因子蛋白質(zhì)TWIST是一種潛在的促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡致癌基因，可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的合成，參與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移［10］。此外，E-cadherin的缺失或減少是影響腫瘤上皮細(xì)胞間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的最重要因素之一，從而使得腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶中分離。E-cadherin是介導(dǎo)細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附的主要分子，在維持上皮細(xì)胞間連接、控制細(xì)胞極性、分化及組織形態(tài)的發(fā)生等方面起重要作用［11］。E-cadherin減少或缺失后，胃癌細(xì)胞間的黏附力減弱，易使癌細(xì)胞彌漫生長，不能形成腺管，容易脫落及向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。E-cadherin的下調(diào)又可以激活β-連蛋白通路，引起VEGF基因表達(dá)增加［12］。VEGFR和Wnt通路調(diào)節(jié)EMT在胰腺、乳腺、結(jié)腸等多種實(shí)體瘤中表達(dá)。

因胃黏膜癌前病變發(fā)展成為癌癥的時(shí)間不確定，而且多數(shù)患者無特異性癥狀，目前對于胃黏膜腸上皮化生及非典型增生的監(jiān)測，主要是內(nèi)鏡、病理等，如將組織或血液中分子標(biāo)志物用于聯(lián)合監(jiān)測，將對臨床有重要的意義。本文結(jié)果顯示，E-cadherin表達(dá)下降和（或）VEGF表達(dá)上調(diào)可參與胃黏膜逐步演變的過程，目前實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示E-cadherin和VEGF表達(dá)異常尚不能作為診斷標(biāo)致物，但可作為腸上皮化生及非典型增生的患者監(jiān)測和隨訪的參考，對于有E-cadherin和VEGF表達(dá)異常的患者加強(qiáng)檢測和隨訪，聯(lián)合檢測其表達(dá)程度，可粗略判斷癌前病變的狀態(tài)，對胃癌的預(yù)防、早期發(fā)現(xiàn)，有一定的參考意義。

如何制定科學(xué)合理的監(jiān)測隨訪方案，甚至對不同危險(xiǎn)因素的患者制定個(gè)體化，提高成本-效益比是臨床診療中的目標(biāo)。對于有E-cadherin和（或）VEGF表達(dá)異常的腸上皮化生及非典型增生的患者，發(fā)生胃癌的概率，預(yù)后的因素，目前尚無報(bào)道，深入研究胃黏膜腸上皮化生和非典型增生的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系，可能為我們逆轉(zhuǎn)癌前病變及分子標(biāo)志物監(jiān)測有一定的臨床參考價(jià)值。

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Correlation between E-cadherin and VEGF expression of the gastric mucosa

WANG Rui，SONG Zheng-yu，YU Yong-qiang，YANG Jie-lin.

First Affiliated Hospital of Hebei North University，075000，China

Objective To explore the correlation between E-cadherin and VEGF by analyzing the expression of E-cadherin and VEGF in chronic gastritis，intestinal metaplasia，atypical hyperplasia，and gastric cancer.Methods The expression of E-cadherin and VEGF was detected in chronic gastritis，intestinal metaplasia，atypical hyperplasia and gastric cancer by immunohistochemistry，so that to investigate the difference and correlation between E-cadherin and VEGF in gastric non-cancerous tissues compared with gastric cancer. Results Compared with gastric cancer group，the positive expression of VEGF was gradually increased in chronic gastritis，intestinal metaplasia，and atypical hyperplasia，while the expression of E-cadherin showed a significant reduction（P＜0.05）.The expression of E-cadherin and VEGF was negatively correlated.Conclusions E-cadherin and VEGF expression was negatively correlated，which both involved in the progression of gastric mucosa.Therefore，combined monitoring the expression of E-cadherin and VEGF might play a significant value for diagnosing precancerous lesions of gastric cancer.

E-cadherin；VEGF；Gastric carcinoma；Precancerous lesions

2014-11-21）

（本文編輯：何美蓉）

10.3969/j.issn.1672-2159.2015.04.001

075000河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院