殷漢華　何雅軍　鄧延梅　潘立武　劉序友　韓馥縵　葉國榮　呂　霞　舒建昌

姜黃素對肝星狀細(xì)胞中髓樣分化因子88蛋白表達(dá)的影響

殷漢華1何雅軍2鄧延梅2潘立武2劉序友2韓馥縵2葉國榮2呂霞2舒建昌2

目的觀察姜黃素干預(yù)前后肝星狀細(xì)胞（HSC）中髓樣分化因子88（MyD88）蛋白的變化水平，以探討姜黃素抗肝纖維化的相關(guān)機(jī)制。方法構(gòu)建pCMV-Myc-MyD88重組質(zhì)粒，將人腎上皮細(xì)胞293T細(xì)胞及HSC-T6細(xì)胞分別設(shè)為空白對照組、MyD88過表達(dá)組、姜黃素+MyD88過表達(dá)組，其中MyD88過表達(dá)組給予轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-MyD88重組質(zhì)粒72 h，姜黃素+MyD88過表達(dá)組在轉(zhuǎn)染48 h后加入姜黃素繼續(xù)作用24 h。采用Western blot法檢測MyD88蛋白表達(dá)。結(jié)果①轉(zhuǎn)染pCMV-myc-MyD88重組質(zhì)粒48 h后，MyD88在293T細(xì)胞及HSC中表達(dá)均明顯增高（P＜0.05），且經(jīng)姜黃素處理后兩類細(xì)胞中表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。②姜黃素處理后MyD88表達(dá)量較MyD88質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論姜黃素可能通過抑制肝星狀細(xì)胞MyD88蛋白表達(dá)，阻斷MyD88依賴性信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

MyD88；姜黃素；肝星狀細(xì)胞

肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵細(xì)胞［1］。姜黃素是由中藥姜黃中提取的活性成分，是研究最多的天然化合物之一，具有廣泛的藥理作用，如誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗氧化、清除氧自由基等［2-3］。我們前期的研究證實(shí)，姜黃素可以抑制HSC的活化增殖，使其停留在G2/M期，并誘導(dǎo)HSC凋亡，其作用具有時間和劑量依賴性［4-7］。Toll樣受體（TLRs）主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、HSC等，屬Ⅰ型跨膜蛋白，可通過MyD88依賴性和TRIF依賴性兩條途徑來傳導(dǎo)細(xì)胞活化信號，與肝臟炎癥損傷、肝纖維化發(fā)生發(fā)展有關(guān)［8-9］。本研究擬觀察髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）蛋白在姜黃素作用前后其在HSC中表達(dá)的改變，從而探討MyD88蛋白與姜黃素之間的關(guān)系，以進(jìn)一步研究姜黃素的抗肝纖維化機(jī)制。

材料與方法

一、一般資料

1.細(xì)胞株

肝星狀細(xì)胞株HSC-T6是由上海中醫(yī)藥大學(xué)徐列明教授饋贈，其具有活化HSC的表型；293T細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

2.試劑

兔抗大鼠MyD88一抗（美國Santa Cruz公司），姜黃素（美國Sigma公司），siRNA Transfection Reagent（美國Santa Cruz公司），β-Actin內(nèi)參一抗（美國EarthOX公司），質(zhì)粒小提試劑盒（DPl03）［（天根生化科技（北京）有限公司］，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Abcam公司），PCR擴(kuò)增試劑盒（美國Abcam公司）。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)液選用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃，5%CO2及飽和濕度，定期在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，根據(jù)生長狀態(tài)進(jìn)行換液，當(dāng)細(xì)胞生長至密度達(dá)到80%～90%時即開始準(zhǔn)備進(jìn)行傳代。

2.RT-PCR

將收集的細(xì)胞提取總RNA。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，根據(jù)Gen－Bank MyD88（No.AY191270.1）的功能編碼區(qū)序列和載體pCMV-Myc序列特點(diǎn)，選擇EcoRI-HF和KpnI作為酶內(nèi)切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)PCR引物序列如下：上游引物：5′-AAT TGA ATT CGG ATG TCT GCG GGA GGC CCC-3′，下游引物：5′-AAT TAA GGT ACC-TCA GGG CAG GGA CAG AGC-3′。參照PCR試劑盒說明書，獲取PCR產(chǎn)物，進(jìn)行電泳。將瓊脂糖凝膠置于核酸/蛋白凝膠圖像成像分析儀采集圖像并保存。

3.構(gòu)建重組質(zhì)粒

影響企業(yè)生存和發(fā)展的因素還有企業(yè)創(chuàng)新。企業(yè)創(chuàng)新其實(shí)就是對商品使用價(jià)值的創(chuàng)新，即對商品有用性的創(chuàng)新，進(jìn)一步講就是創(chuàng)有效勞動之新。如果不是對有效勞動創(chuàng)新，企業(yè)不斷重復(fù)的勞動可能就會變成無效勞動，生產(chǎn)的產(chǎn)品就是無用產(chǎn)品，產(chǎn)品銷售不出去，就不能實(shí)現(xiàn)商品價(jià)值，最終受損的是商品所有者。創(chuàng)新商品使用價(jià)值，提高產(chǎn)品性能，提升商品原有的有用性，增加產(chǎn)品多樣性，在市場上賣出更高的價(jià)格，從而獲得更好的收益。國家提出供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革與創(chuàng)新使用價(jià)值在本質(zhì)上是一致的。因此企業(yè)要想立于不敗之地成為行業(yè)領(lǐng)軍者，就要加強(qiáng)對使用價(jià)值的創(chuàng)新，不能抱殘守缺。

將酶切MyD88 DNA片段及載體質(zhì)粒及DNA回收后，連接MyD88 DNA片段及載體質(zhì)粒，經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、篩選及質(zhì)粒抽提后，重建質(zhì)粒酶切鑒定及測序。

4.重建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞

HSC-T6及293T常規(guī)培養(yǎng)傳代，取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，采用無雙抗培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度稀釋至8×104/mL，取2 mL/孔種6孔板，37℃，5%CO2及飽和濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分3組進(jìn)行轉(zhuǎn)染：①空白對照組；②重組質(zhì)粒組；③重組質(zhì)粒組+姜黃素組。取6 μL siRNA Transfection Reagent加入92 μL不含血清的DMEM中，另取12 μg重組質(zhì)粒加入88 μL不含血清的DMEM中，將兩者混合，輕輕吹打混勻，室溫孵育25 min，加入800 μL DMEM中混勻，加入到6孔板中培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞8 h，更換含10%胎牛血清的無雙抗培養(yǎng)液4 mL繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

5.Western bolt

收集各組細(xì)胞蛋白后，進(jìn)行蛋白定量，配制SDS-PAG凝膠進(jìn)行蛋白電泳，每孔上樣20～30 μL，樣本的兩側(cè)泳道加入預(yù)染的蛋白Markers作為指示參考。經(jīng)轉(zhuǎn)膜后孵育一抗，MyD88抗體溶液、β-Actin抗體溶液，置于4℃下的搖床上孵育過夜。次日，用TBST液2～3次，10 min/次。二抗孵育2 h，再以TBST液清洗2～3次，每次10 min，取等體積的ECL發(fā)光劑A液、B液并混勻，顯影，設(shè)置曝光時間，采圖并保存結(jié)果。使用相配套的Image Lab分析軟件測定蛋白相對表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，所得數(shù)據(jù)均以x±s表示，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析或獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、Pcmv-Myc-MyD88重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

二、MyD88在293T細(xì)胞中的表達(dá)及姜黃素對其表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，瞬時轉(zhuǎn)染pCMV-myc-MyD88重組質(zhì)粒于293T細(xì)胞48 h后MyD88蛋白表達(dá)量較空白組明顯增高（1.462±0.276 vs 0.438±0.087），姜黃素處理后其表達(dá)量較MyD88質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組明顯降低（0.734±0.157 vs 1.462± 0.276）（圖1）。

圖1　姜黃素對293T細(xì)胞中MyD88表達(dá)的影響（*與空白組比較，P＜0.05；#與MyD88質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，P＜0.05）

三、MyD88在HSC細(xì)胞中的表達(dá)及姜黃素對其表達(dá)影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，瞬時轉(zhuǎn)染pCMV-myc-MyD88重組質(zhì)粒48 h后MyD88蛋白表達(dá)量較空白組明顯增高（0.413±0.089 vs 0.847±0.131），姜黃素處理后其表達(dá)量較MyD88質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組明顯降低（0.847±0.131 vs 0.362±0.057）（圖2）。

圖2　姜黃素對肝星狀細(xì)胞中MyD88表達(dá)的影響（*與空白組比較，P＜0.05；#與MyD88質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，P＜0.05）

討論

本研究通過構(gòu)建pCMV-myc-MyD88重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞及HSC-T6中使MyD88蛋白過表達(dá)，并以姜黃素干預(yù)前后檢測其蛋白表達(dá)量的變化，以觀察姜黃素對該蛋白表達(dá)的影響，從而確定姜黃素對HSC中MyD88依賴性信號通路的影響。

HSC活化是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。各種損傷因素通過不同方式和途徑作用于肝臟，引起肝細(xì)胞、庫弗細(xì)胞等損傷、壞死、凋亡及肝組織炎癥反應(yīng)，釋放大量、多種細(xì)胞因子等，通過多種途徑激活HSC并轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞，大量合成和分泌膠原等細(xì)胞外基質(zhì)，最終引起肝纖維化、肝硬化。

人及哺乳動物存在一個TLR家族，可以識別病原菌，激活導(dǎo)致機(jī)體有效防御基因的轉(zhuǎn)錄，從而啟動特異性和非特異性免疫反應(yīng)抵抗病菌人侵。

Toll樣受體（TLRs）主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、HSC等，屬Ⅰ型跨膜蛋白，主要作用是識別不同的病原分子并發(fā)揮受體活化后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，通過識別入侵病原微生物的配體，激發(fā)天然免疫應(yīng)答，啟動促炎癥細(xì)胞因子和共刺激分子的表達(dá)，可增強(qiáng)細(xì)胞因子的合成與釋放能力并進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，是機(jī)體介導(dǎo)天然免疫轉(zhuǎn)向獲得性免疫的橋梁，其可通過MyD88依賴性和TRIF依賴性途徑兩條途徑來傳導(dǎo)信號活化，與肝臟的炎癥損傷有關(guān)［8-9］。

TLRs的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要有兩條，MyD88依賴性和TRIF依賴性。TLR l、2、5、7、9和10是通過MyD88依賴性途徑。在MyD88依賴性途徑中，MyD88是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵蛋白［10］。

肝臟組織內(nèi)的實(shí)質(zhì)細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中均可見TLR表達(dá)，如肝細(xì)胞表達(dá)TLR1-9，HSC表達(dá)TLR2與TLR4。在內(nèi)毒素刺激下表達(dá)增加，同時活化細(xì)胞，通過細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最終活化NF-資B并調(diào)控反應(yīng)性基因的轉(zhuǎn)錄，合成并分泌大量致纖維化的細(xì)胞因子，如TGF-β、TNF-α、ICAM-1、IL-1、IL-2、IL-8和IL-12等。再次通過一系列途徑作用于成纖維細(xì)胞，促使其增殖并表達(dá)α-SMA，發(fā)生細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化，從而分化為肌成纖維細(xì)胞，合成和分泌膠原蛋白，導(dǎo)致過量的細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟內(nèi)沉積而致肝纖維化［11-12］。腸源性內(nèi)毒素（主要成分為LPS）入肝后，可激活庫普弗細(xì)胞，啟動TLR4信號通路，分泌TNF-a、IL-1β等細(xì)胞因子。人活性HSC表達(dá)TLR4、CD14，并能識別LPS而分泌致炎細(xì)胞因子。HSC能直接識別LPS及其他TLR配體，并促進(jìn)纖維組織增生［13］。

293T細(xì)胞就是一種表達(dá)SV40病毒T抗原的細(xì)胞系，來源于人胚胎腎細(xì)胞293HEK，經(jīng)改造后在其中插入了T抗原，用293T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染可以獲得較高的表達(dá)水平。293T細(xì)胞可用于篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。在本研究中293T細(xì)胞用于檢測轉(zhuǎn)染效率并作為對照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)將pCMV-myc-MyD88重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染HSC-T6及293T后MyD88蛋白表達(dá)量明顯增加（P＜0.05），予以姜黃素作用后檢測MyD88蛋白表達(dá)量下降（P＜0.05），說明姜黃素可以降低MyD88蛋白的表達(dá)，從而抑制MyD88依賴性信號通路，進(jìn)而抑制HSC的活化、增生等，這可能是姜黃素發(fā)揮抗肝纖維的作用的機(jī)制之一，具體的分子機(jī)制需進(jìn)一步研究。

本研究從姜黃素與MyD88的關(guān)系入手，發(fā)現(xiàn)姜黃素可抑制MyD88蛋白表達(dá)，可能是姜黃素抗肝纖維的作用機(jī)制之一，并且有助于進(jìn)一步探討將TLRs和MyD88蛋白作為早期診斷肝纖維化的指標(biāo)，或作為治療肝纖維化的靶點(diǎn)之一。

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Effects of curcumin on the expression of myeloid differentiation factor 88 protein in hepatic stellate cells

YIN Han-ping1，HE Ya-jun2，DENG Yan-mei2，PAN Li-wu2，LIU Xu-you2，HAN Fu-man2，YE Guo-rong2，LV Xia2，SHU Jian-chang2.
1）Heyuan Hospital of Traditional Chinese Medicine；
2）Department of Gastroenterology，The Fourth Affiliated Hospital of the Medical College of Jinan Uiversity/Guangzhou Red Cross Hospital，Guangzhou 510220

Objective To observe the expression difference of myeloid differentiation factor 88（MyD88）protein in hepatic stellate cell（HSC）treated with curcumin，and to investigate the related mechanism of the anti-fibrotic effect of curcumin.Methods 293T cell and HSC cell were individually divided into control group，vector of MyD88 plasmid group，and curcumin+vectors of MyD88 plasmid group.The expression of MyD88 was detected by Western blot.Results①After transfection of pCMV-Myc-MyD88，the expression of MyD88 was significantly increased（P＜0.05），while the expression of MyD88 in curcumin+vectors of MyD88 plasmid group was significantly decreased than vectors of MyD88 plasmid group（P＜0.05）.②After transfection of pCMV-Myc-MyD88 HSC，the expression of MyD88 was significantly increased（P＜0.05）.The expression of MyD88 in curcumin+vectors of MyD88 plasmid group was significantly decreased compared with vectors of MyD88 plasmid group（P＜0.05）.Conclusions Curcumin might prevent liver fibrosis by inhabiting the expression of MyD88 protein and blocking MyD88-dependent signaling pathway.

MyD88；Curcumin；Hepatic stellate cells

2014-11-24）

（本文編輯：白嵐）

10.3969/j.issn.1672-2159.2015.04.007

1 517000廣東省河源市中醫(yī)院；2 510220暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第四醫(yī)院/廣州市紅十字會醫(yī)院

舒建昌，E-mail：shujc62@hotmail.com

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（20120318023），廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2020314），中國肝炎防治基金會王寶恩肝纖維化研究基金項(xiàng)目（CFHPC20131014）