李玉華， 段　斐， 周小羽， 李　揚(yáng)， 李潤生

（1. 吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，長春 130021；2. 上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所，上海 200032）

小鼠精原細(xì)胞的分離純化

李玉華1，2， 段斐2， 周小羽2， 李揚(yáng)1， 李潤生2

（1. 吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，長春 130021；2. 上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所，上海 200032）

目的建立一種高效、簡便的分離純化小鼠精原細(xì)胞的方法。方法利用膠原酶IV/ 脫氧核糖核酸酶I（DNaseI）/分散酶（dispase）組合酶消化法和差異性貼壁原理，從新生小鼠睪丸中分離、純化精原細(xì)胞。經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、視黃酸激活基因8（Stra8）免疫化學(xué)鑒定精原細(xì)胞并進(jìn)行純度分析。結(jié)果分離到的細(xì)胞經(jīng)Stra8檢測呈陽性， 精原細(xì)胞純度可達(dá)86%。結(jié)論該方法可高效地分離和純化小鼠精原細(xì)胞。

小鼠； 精原細(xì)胞； 分離； 純化

哺乳動物的精子發(fā)生從精原細(xì)胞有絲分裂成精母細(xì)胞，再經(jīng)減數(shù)分裂成圓形精子細(xì)胞，經(jīng)過精子變形階段形成精子是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。在體外研究精子的發(fā)生機(jī)制及其影響因素一直是生殖研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要內(nèi)容，而精原細(xì)胞的獲取是體外生殖細(xì)胞研究的基本條件，因此需要建立一種簡單可行的方法，獲得較高純度和活力的精原細(xì)胞以滿足實(shí)驗(yàn)需要。

目前分離和純化精原細(xì)胞的方法主要是組合酶消化法（膠原蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、胰酶等），結(jié)合 Percoll 不連續(xù)密度梯度離心［1］、免疫磁珠分選法［2］、流式細(xì)胞儀分選法［3］等，可以得到高純度的精原細(xì)胞。然而，這些純化方法較為繁瑣，操作時(shí)間長，試劑昂貴且需要一定的儀器設(shè)備，因而限制了這些方法在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)研究中的使用。

作者根據(jù)現(xiàn)行常用方法進(jìn)行了消化酶組合的優(yōu)化， 利用差速貼壁法獲得純度和活力較高的精原細(xì)胞，為深入研究生精機(jī)理以及相關(guān)領(lǐng)域的研究建立基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

8周齡C57BL/6JSlac雄鼠5只，雌鼠10只，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司［SCXK（滬）2012-0002］，雌雄2:1合籠。選擇出生后7～8日齡的小鼠作為實(shí)驗(yàn)對象。

1.2主要試劑

膠原酶Ⅳ， 脫氧核糖核酸酶I（DNase I）均購自Sigma公司， 分散酶（dispase）購自Roche公司； 胎牛血清（FBS）購自Biowest公司； 兔抗視黃酸激活基因8（Stra8）抗體購自Abcam公司。

1.3小鼠睪丸HE染色

7～8日齡小鼠的睪丸經(jīng)Bouin固定，常規(guī)技術(shù)操作包埋成蠟塊、切片，伊紅蘇木素（HE）染色。

1.4小鼠精原細(xì)胞的分離

方法［4，5］，應(yīng)用組合酶法以及差異性貼壁原理分離精原細(xì)胞， 經(jīng)過條件摸索和優(yōu)化， 采用方法如下。每組10～20只7～8日齡雄性小鼠， 腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%（w/v）戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。無菌剪取兩側(cè)睪丸，放在磷酸鹽PBS緩沖液中，小心剝除睪丸的白膜， 用鑷子將睪丸小管磨成小段， 松散的小管用移液槍反復(fù)吹打直至完全散開。用5 mL PBS 洗滌， 靜置沉降， 去除間質(zhì)細(xì)胞，收集曲精小管，重復(fù)該步驟2次。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%（w/v）膠原酶IV+100 μg/mL DNaseⅠ溶液， 37 ℃ 消化20 min，其間每隔5 min輕輕吹打一次，收集單細(xì)胞和小管，再用2 U/mL分散酶 + 100 μg/mL DNase I37 ℃消化20 min左右，消化結(jié)束后反復(fù)吹打形成單細(xì)胞懸液，經(jīng)過200目不銹鋼鋼篩過濾，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞。

1.5小鼠精原細(xì)胞的純化

單細(xì)胞懸液加入到預(yù)先用0.1%（w/v）明膠包被過的培養(yǎng)皿中， 用DMEM∶F12 （1∶1）+ 10%（v/v）FBS培養(yǎng)基，5%（v/v）CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，可見有大量細(xì)胞已經(jīng)貼壁，小心吸取未貼壁細(xì)胞置于新的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，重復(fù)貼壁操作，最后吸取懸浮細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h，離心收集未貼壁的精原細(xì)胞。

1.6小鼠精原細(xì)胞的鑒定及純度分析

分離到的精原細(xì)胞，采用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察和Stra8免疫化學(xué)方法鑒定。細(xì)胞經(jīng)4% （w/v）多聚甲醛固定后，滴片于防脫玻片上，室溫晾干備用。PBS洗滌后，用0.l %（v/v） TritonX-100處理10 min，磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗滌，3% （v/v） H2O2作用10 min。充分洗滌后，正常山羊血清37 ℃封閉30 min； 滴加兔抗Stra8一抗（1∶200）4 ℃過夜，陰性對照用羊IgG代替一抗；PBST洗滌后，加Biotin標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶200）37 ℃孵育1 h，PBST洗滌，加Streptavidin-HRP（1∶200）37 ℃孵育1 h， 充分洗滌后，DAB顯色， 蘇木素復(fù)染， 0.5%（v/v）HCl分化。常規(guī)脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中呈陽性反應(yīng)的細(xì)胞個(gè)數(shù)， 計(jì)算分離到的精原細(xì)胞純度。

2　結(jié)果

2.1小鼠精原細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析

7～8日齡小鼠睪丸組織經(jīng)HE染色觀察，曲精小管管腔中靠近基底膜的精原細(xì)胞體積較大，核卵圓形，多個(gè)核仁靠近核膜；近管腔的精原細(xì)胞體積略小，呈圓形，有2～3個(gè)核仁（圖1A）。分離到的細(xì)胞在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)皿底有極少量的貼壁細(xì)胞，絕大多數(shù)為懸浮的呈圓形或近圓形的小鼠精原細(xì)胞，胞質(zhì)少，核大而圓，以單個(gè)、成對或串珠狀排列，折光性強(qiáng)（圖1B）。

2.2Stra-8免疫化學(xué)鑒定

分離到的細(xì)胞， 經(jīng)過生殖細(xì)胞標(biāo)志物Stra8免疫化學(xué)鑒定， 結(jié)果顯示絕大部分細(xì)胞都呈棕色的陽性反應(yīng)信號（圖1C）， 陰性對照組（圖1D）沒有陽性信號。

2.3精原細(xì)胞的純度分析

顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中stra-8呈陽性反應(yīng)的細(xì)胞個(gè)數(shù)，結(jié)果顯示分離到的精原細(xì)胞純度達(dá)86%。

3　討論

在7～8 日齡小鼠的睪丸曲細(xì)精管生精上皮中，主要存在2種類型的細(xì)胞，即精原細(xì)胞和支持細(xì)胞。其中A型精原細(xì)胞占17%，B型精原細(xì)胞占10%，支持細(xì)胞占73%［6］。因此，7～8日齡小鼠睪丸是理想的精原細(xì)胞來源。分離小鼠精原細(xì)胞的方法， 目前應(yīng)用最為廣泛的是組合酶消化法［7］，多數(shù)采用膠原蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、胰酶組合消化小鼠睪丸組織，結(jié)合機(jī)械吹打使得生精小管消化成單個(gè)細(xì)胞。經(jīng)過多次條件優(yōu)化，本實(shí)驗(yàn)最終確定酶組合為：膠原酶Ⅳ，DNase I以及分散酶。膠原酶主要用于消化細(xì)胞間質(zhì)和管周肌樣細(xì)胞，先用機(jī)械剝離法分離出曲細(xì)精管，由于曲細(xì)精管之間的間質(zhì)細(xì)胞連接松散，通過膠原酶消化、機(jī)械吹打基本可以去除間質(zhì)細(xì)胞。酶組合中加入DNase I，用于降解分離過程中死細(xì)胞所釋放的DNA，降低細(xì)胞之間的粘附和細(xì)胞消化液的粘稠度。最初在摸索條件時(shí)，曾使用0.25%的胰蛋白酶，但是胰酶消化的時(shí)間和程度較難把握，很容易造成過度消化損傷細(xì)胞膜，或者消化不足，從而降低細(xì)胞得率和存活率。后改用分散酶替代胰蛋白酶，分散酶是一種非特異性的中性蛋白酶，能很溫和地消化細(xì)胞外基質(zhì)，釋放出單個(gè)細(xì)胞，而且不破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)［8］，能明顯提高細(xì)胞的存活率和細(xì)胞得率。

從單細(xì)胞懸液中進(jìn)行精原細(xì)胞的純化， 常用的方法包括差速貼壁法、流式細(xì)胞儀分選法［3］、Percoll不連續(xù)密度梯度離心法［9］、免疫磁珠分選法［2］等。本文作者最初采用Percoll不連續(xù)密度梯度離心法純化精原細(xì)胞，但效果并不理想，一是分層不清，二是細(xì)胞損失嚴(yán)重，得率低。因此采用了差速貼壁法，差速貼壁法的原理是支持細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)易于貼壁，而精原細(xì)胞單獨(dú)貼壁困難，利用這一差異性可以進(jìn)行精原細(xì)胞的純化。分離到的單細(xì)胞懸液經(jīng)反復(fù)差速貼壁后，可消除絕大部分支持細(xì)胞和管周肌樣細(xì)胞等，從而提高生精細(xì)胞的純度。差異貼壁法的優(yōu)點(diǎn)主要是操作簡單，有效，而且對精原細(xì)胞沒有損傷。

圖1　小鼠精原細(xì)胞形態(tài)學(xué)及免疫化學(xué)鑒定Figure 1　Identification of isolated mouse spermatogonia by morphology and immunochemistry

Stra8 （stimulated by retinoic acid gene 8）基因是哺乳動物生殖細(xì)胞由有絲分裂轉(zhuǎn)變?yōu)闇p數(shù)分裂前特異表達(dá)的基因，在出生后至成年僅在睪丸減數(shù)分裂前的生精細(xì)胞上表達(dá)，常常用來作為睪丸生殖細(xì)胞的標(biāo)志物［10］。通過檢測分離到的細(xì)胞中stra8的表達(dá)情況來判斷精原細(xì)胞的特異性和純度。本實(shí)驗(yàn)分離到的小鼠精原細(xì)胞經(jīng)過Stra8免疫化學(xué)鑒定分析，純度可達(dá)86%。分離純化效果優(yōu)于張曉麗等人報(bào)道的膠原酶、透明質(zhì)酸酶、胰酶組合及Percoll不連續(xù)密度梯度離心法［11］，也高于王永彬等［12］所使用的膠原酶和胰酶組合法結(jié)合Percoll 不連續(xù)密度梯度離心純化得到的精原干細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)采用的膠原酶IV/DNase I/Dispase組合酶消化法結(jié)合差速貼壁法可以制備出高純度、高質(zhì)量的精原細(xì)胞，完全能滿足體外實(shí)驗(yàn)的需要。

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Isolation and Purification of Mouse Spermatogonia

LI Yu-hua1，2， DUAN Fei2， ZHOU Xiao-yu2， Li Yang1， LI Run-sheng2
（1. Department of Pathophysiology， Norman Bethune College of Medical Sciences， Jilin University， Changchun 130021， China； 2. Shanghai Institute of Planned Parenthood Research， Shanghai 200032， China）

ObjectiveTo establish a simple and efficient method for separation and purification of mouse spermatogonia. MethodsSpermatogonia were isolated and purified from neonatal mouse testis using collagenase IV/DNase I/dispase combination enzymatic digestion and differential velocity of cell adherence method. Isolated spermatogonia were analyzed by morphology and stra8 immunochemistry. ResultsThe isolated spermatogonia were stra8 positive and cell purity was as high as 86%. Conclusion This method is efficient for separation and purification of mouse spermatogonia .

Mouse； Spermatogonia； Isolation； Purification

R321.1 Q95-33

A

1674-5817（2015）01-0042-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.01.009

2015-01-25

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號81270760）

李玉華（1974-）， 女， 在職博士研究生， 從事生殖醫(yī)學(xué)研究工作， E-mail: li_yuhua@163.com

李潤生， E-mail: runshengli2007@163.com 李揚(yáng)， E-mail: lyang@jlu.edu.cn