吳　偉，劉懷然，劉勝旺，，陳洪巖，

（1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 哈爾濱 150030； 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 哈爾濱 150001）

一株鴨源新城疫病毒分子特性及對(duì)SPF雞、鴨致病性的比較研究

吳偉1，劉懷然2，劉勝旺1，2，陳洪巖1，2

（1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 哈爾濱 150030； 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 哈爾濱 150001）

目的研究一株鴨源新城疫病毒分子的特性，并比較其對(duì)SPF雞和SPF鴨致病性的不同。方法 將分離到的病毒克隆、測(cè)序并用SPF雞和SPF鴨分別評(píng)價(jià)該毒株的致病性。結(jié)果Du/CH/ LGD/358/2011的基因組由15 198個(gè)核苷酸序列組成，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白。F基因裂解位點(diǎn)的氨基酸序列為112 ERQER/L117。通過(guò)全基因組核苷酸序列和F基因高變區(qū)核苷酸序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)，證明該毒株屬于class I基因3b型，與香港活禽市場(chǎng)分離到的毒株類(lèi)似，但略有不同。該毒株對(duì)SPF雞和SPF鴨的致病性基本一致。結(jié)論該毒株為弱毒株，使用SPF雞和SPF鴨均可以對(duì)鴨源弱毒株進(jìn)行致病性評(píng)價(jià)，為SPF鴨的檢測(cè)提供理論依據(jù)。

新城疫病毒； SPF鴨； SPF雞； 致病性； 分子特性

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，該病一旦爆發(fā)會(huì)對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。NDV 又稱(chēng)為禽I型副黏病毒（Avian Paramyxovirus I）為單股負(fù)鏈、不分節(jié)段的RNA 病毒，屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）的腮腺炎病毒屬（Avulavirus）。NDV主要編碼以下6種結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白（nucleoprotein， NP）、磷蛋白（phosphoprotein， P）、基質(zhì)蛋白（matrix protein， M）、融合蛋白（fusion protein，F(xiàn)）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（hemagglutininneuraminidase，HN）和RNA依賴(lài)性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，L）［2］。此外，P基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中還會(huì)出現(xiàn)RNA編輯現(xiàn)象，因而產(chǎn)生兩種額外的蛋白質(zhì)（V蛋白和W蛋白）［3］。雖然NDV只有一個(gè)血清型，但根據(jù)全基因組序列和F基因高變區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育分析可將所有毒株分為class I 和class II兩大類(lèi)，其中class I分為9個(gè)基因型，class II 分為15個(gè)基因型［4］。

NDV宿主非常廣泛，但NDV對(duì)不同宿主的致病性有很大差異［5］。最近一些報(bào)道表明，無(wú)毒的NDV在從水禽傳播給雞群后， 可能會(huì)變成強(qiáng)毒株［6］。因此，為了避免ND的再次爆發(fā)，對(duì)弱毒株的研究也變得尤為重要。本研究從廣東省健康鴨中分離到一株NDV，對(duì)其分子特性及對(duì)SPF雞和SPF鴨致病性進(jìn)行比較研究，有助于正確了解弱毒鴨源NDV對(duì)SPF雞和SPF鴨的致病性，對(duì)于科學(xué)的防控ND具有重要的指導(dǎo)意義。

鴨等水禽養(yǎng)殖在我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)中占有重要地位，我國(guó)已是世界上最大的水禽養(yǎng)殖國(guó)，開(kāi)展水禽疫病研究及相關(guān)制品研發(fā)十分重要，而SPF鴨則是開(kāi)展水禽疫病研究、相關(guān)制品研發(fā)及制品生產(chǎn)、檢驗(yàn)必不可少的高品質(zhì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。目前我國(guó)對(duì)SPF鴨的凈化培育工作尚在進(jìn)行中，鴨源NDV是SPF鴨微生物學(xué)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提出及檢測(cè)方法建立重要的關(guān)注點(diǎn)之一，也正是開(kāi)展本研究的出發(fā)點(diǎn)。

1　材料與方法

1.1病毒來(lái)源與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

NDV Du/CH/LGD/358/2011株分離于2011年廣東省健康鴨泄殖腔拭子。SPF雞胚、SPF雞、SPF鴨胚和SPF鴨由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所國(guó)家禽類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心提供［SYXK （黑）2006-032］。SPF雞、SPF鴨NDV感染實(shí)驗(yàn)在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物用生物制品國(guó)家工程研究中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行［SYXK （黑）2006-032］。

1.2主要實(shí)驗(yàn)材料

RNAiso Plus、One Step RT-PCR Kit Ver.2、3'-Full RACE Core Set Ver.2、Clontech SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit、DNA Maker、pMD18-T載體均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA純化回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；Top10感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；引物由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并保存。

1.3病毒的分離與鑒定

將鴨泄殖腔拭子浸泡在含雙抗的PBS中，用旋渦混合器高速震蕩，震蕩完畢后8 000 r/min離心10 min， 吸取上清液并用0.22 μm的濾器過(guò)濾， 取濾液接種9～11日齡的SPF雞胚， 0.1 mL/枚， 37 ℃培養(yǎng)。72 h收集雞胚的尿囊液，然后按常規(guī)方法進(jìn)行血凝（HA）試驗(yàn)和血凝抑制（HI）試驗(yàn)，將判定為NDV陽(yáng)性的病毒命名為 Du/CH/LGD/358/2001。

1.4病毒RNA的提取以及基因組RT-PCR擴(kuò)增

按照說(shuō)明從繁殖病毒的尿囊液中直接提取病毒RNA，采用一步法RT-PCR擴(kuò)增病毒基因組全長(zhǎng)。反應(yīng)程序?yàn)? 50 ℃ 30 min，94 ℃ 2min； 94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 10 min?；蚪M5'端和3'端的序列分別參照Clontech SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit和3'-Full RACE Core Set Ver.2的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行擴(kuò)增。

1.5PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序分析

將擴(kuò)增的片段分別克隆于pMD18-T載體中，由北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序后用DNAStar軟件進(jìn)行全基因序列的拼接。根據(jù)參考毒株的基因組序列，分析并推導(dǎo)出毒株6個(gè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列與GenBank中其他參考毒株做同源性分析。并以MEGA5.0軟件對(duì)該病毒株的全基因組以及F基因高變區(qū)序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

1.6雞胚、鴨胚半數(shù)感染量（EID50）的測(cè)定

用PBS倍比稀釋病毒尿囊液，取10-5～10-9這5個(gè)稀釋度分別接種SPF雞胚、SPF鴨胚，每個(gè)稀釋度分別接種5枚9日齡SPF雞胚、SPF鴨胚，0.1 mL/枚，37℃培養(yǎng)5 d，每日觀察1次，記錄各稀釋度接種胚的死亡胚數(shù)，5 d后記錄被感染的胚數(shù)，用Reed-Muench法計(jì)算EID50。

1.7雞胚、鴨胚平均死亡時(shí)間（MDT）的測(cè)定

用PBS倍比稀釋病毒尿囊液，取10-1～10-4這4個(gè)稀釋度分別接種SPF雞胚、SPF鴨胚，每個(gè)稀釋度分別接種5枚9日齡SPF雞胚、SPF鴨胚，0. 1 mL/枚，37℃培養(yǎng)7 d，每隔8 h照胚觀察，記錄每個(gè)胚的死亡時(shí)間。

1.81日齡雛雞、雛鴨腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）的測(cè)定

將病毒尿囊液用PBS做10倍的倍比稀釋?zhuān)♂尯蠓謩e接種10只出殼后24～36 h的SPF雞、SPF鴨，每只腦內(nèi)接種0.05 mL，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組4只，相同劑量接種PBS。每日觀察雞群的健康狀況，將正常雞記為0，發(fā)病雞記為1，死亡雞記為2，連續(xù)觀察8 d，最后按公式求出ICPI。

2　結(jié)果

2.1病毒的分離鑒定

接種病毒濾液的SPF雞胚出現(xiàn)NDV典型病變，雞胚尿囊液的血凝價(jià)為1∶256。經(jīng)血凝抑制試驗(yàn)鑒定為NDV， 與禽流感陽(yáng)性血清的試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.2Du/CH/LGD/358/2011的全基因組序列擴(kuò)增、克隆及測(cè)序

從Du/CH/LGD/358/2011病毒RNA中擴(kuò)增出11條與預(yù)計(jì)大小相符的片段（圖1）。將擴(kuò)增片段分別克隆于pMD18-T載體中，篩選重組陽(yáng)性質(zhì)粒，每個(gè)片段選擇3個(gè)以上獨(dú)立克隆進(jìn)行測(cè)序，保證病毒株序列測(cè)定的準(zhǔn)確性。

2.3Du/CH/LGD/358/2011全基因組序列的分析

將RT-PCR擴(kuò)增出的11條目的片段克隆，測(cè)序后通過(guò)DNAStar軟件進(jìn)行拼接。結(jié)果表明，Du/ CH/LGD/358/2011病毒株的基因組全長(zhǎng)為15 198 bp，符合NDV基因組長(zhǎng)度的“6的倍數(shù)”規(guī)則［7］。與參考病毒株NDV08-004進(jìn)行比較，顯示該分離株基因組的組成特征為3'-NP-P-M-F-HN-L-5'， 符合NDV基因組組成特征。與參考毒株La Sota基因組比較， Du/CH/LGD/358/2011基因組在2 381和2 382位之間有12nt的插入， 插入序列為CGGGAAACGGGG， 符合class I病毒株基因組組成特征。該分離株的F基因ORF共有1 662nt， 編碼553個(gè)氨基酸，裂解位點(diǎn)為112 ERQER/L117， 屬于弱毒株裂解區(qū)氨基酸序列特點(diǎn)， 與其生物學(xué)特性相符。根據(jù)DNAStar軟件推導(dǎo)的Du/CH/LGD/358/2011的各個(gè)蛋白的氨基酸序列與Genbank中各基因型代表毒株的各個(gè)蛋白的氨基酸做同源性比較分析結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1　NDV全基因組的RT-PCR擴(kuò)增的11個(gè)重疊片段電泳圖譜Figure 1　RT-PCR amplifications of the 11 overlapping fragments covering the whole genome of NDV

2.4系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將Du/CH/LGD/358/2011全基因組序列與已發(fā)表的21株全基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果表明該毒株為class I 基因3型毒株（圖2）。為進(jìn)一步對(duì)該毒株的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析，以該毒株的F基因高變區(qū)的序列（47～420 nt）和其他24株class I參考毒株的相應(yīng)區(qū)域繪制進(jìn)化樹(shù)。基因分型的結(jié)果與全基因組繪制的進(jìn)化樹(shù)相一致，并且進(jìn)一步地將該毒株劃分為3b亞型（圖3）。

表1　毒株Du/CH/LGD/358/2011與NDV代表毒株基因組與氨基酸的同源性比較Table 1　Similarity comparisons of genome and predicted protein sequences between Du/CH/LGD/358/2011 isolate and other typical NDVs　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　%

圖2　NDV全基因組核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析Figure 2　Phylogenetic tree constructed on the basis of the complete genomes of NDV

圖3　F基因高變區(qū)核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析Figure 3　Phylogenetic tree constructed on the basis of the partial F gene

2.5Du/CH/LGD/358/2011對(duì)SPF雞和SPF鴨的致病性

毒株Du/CH/LGD/358/2011對(duì)SPF雞胚的半數(shù)感染量（EID50）為10-8.63/0.1 mL； 對(duì)SPF鴨胚的半數(shù)感染量（EID50）為10-8.38/0.1 mL。該毒株對(duì)SPF雞的ICPI值為0； 對(duì)SPF鴨的ICPI值為0.05。該毒株對(duì)SPF雞胚和SPF鴨胚分別進(jìn)行MDT試驗(yàn)，從10-1到10-4這四個(gè)稀釋度均未造成雞胚和鴨胚全部死亡。綜合以上數(shù)據(jù)表明，弱毒鴨源NDV對(duì)SPF雞和SPF鴨的致病性基本一致。

3　討論

新城疫是由新城疫病毒引起的一種急性，高度接觸性的烈性傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報(bào)告A類(lèi)疫病。自1926年以來(lái)，在全球范圍內(nèi)至少已造成4次大流行，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。水禽曾被認(rèn)為是NDV潛在的宿主，即使感染強(qiáng)毒的NDV也通常表現(xiàn)出較少或不表現(xiàn)任何臨床癥狀［8］。但是1997年之后我國(guó)陸續(xù)出現(xiàn)了鵝和鴨感染新城疫并伴隨較高的發(fā)病率和死亡率的報(bào)道，很多學(xué)者開(kāi)始重視水禽感染NDV的研究。本研究從中國(guó)廣東省的一只健康鴨中分離得到一株NDV，其基因組長(zhǎng)度為15 198nt，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白。其裂解位點(diǎn)序列為112ERQER/L117符合弱毒株序列特點(diǎn)，與其生物學(xué)特性相一致。根據(jù)全基因組核苷酸序列和F基因高變區(qū)核苷酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)， 結(jié)果表明Du/CH/LGD/358/2011屬于class I基因3b型，與香港活禽市場(chǎng)的雞群中發(fā)現(xiàn)的病毒類(lèi)似［9，10］，說(shuō)明這種類(lèi)型的弱毒株可以在水禽和陸禽之間傳播。由于這種鴨源的class I NDV具有傳播到雞群的可能，且在選擇壓力下有可能發(fā)生毒力增強(qiáng)。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)鴨源新城疫病毒的主動(dòng)監(jiān)測(cè)和預(yù)防。

將該毒株與 21個(gè)參考毒株的全基因組核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，同源性在71.5%～97.2%，其中與CH/ZJ/10/03同源性最高達(dá)到97.2%，與另外兩株class I毒株同源性也在90%以上， 而與其他class II毒株的同源性?xún)H在71.2%～72.7%。又將該毒株與21個(gè)參考毒株的各個(gè)蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)NP、M、L蛋白相對(duì)保守，而P蛋白氨基酸序列差異最大，可能是因?yàn)閏lass I毒株相比于class II毒株在P蛋白有4個(gè)氨基酸序列的插入造成的。由于class I和class II毒株的全基因組核苷酸序列和各結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列之間存在較大的差異，因此可能導(dǎo)致毒株之間的抗原差異較大。目前我國(guó)使用的NDV疫苗主要為L(zhǎng)a Sota、V4和Mukteswar，均為class II類(lèi)弱毒株，它們對(duì)大部分強(qiáng)毒株起到較好的保護(hù)作用，但對(duì)class I類(lèi)毒株保護(hù)性可能相對(duì)較差。因此，能夠?qū)lass I類(lèi)毒株產(chǎn)生良好保護(hù)性的新疫苗顯得十分重要。該毒株對(duì)SPF雞和SPF鴨的致病性試驗(yàn)結(jié)果基本一致，表明對(duì)鴨源弱毒NDV致病性的評(píng)價(jià)，采用SPF雞和SPF鴨均可。

通過(guò)對(duì)該毒株的研究表明，在檢測(cè)SPF鴨是否攜帶NDV時(shí)，可以采用血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)來(lái)鑒定或設(shè)計(jì)保守引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR來(lái)鑒定。反轉(zhuǎn)錄PCR具有特異、快速、靈敏、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，還能消除常規(guī)血清學(xué)檢測(cè)中非特異性因素的干擾及敏感性的問(wèn)題。因此，可以作為SPF鴨檢測(cè)NDV的一種重要方法之一。

［1］孫委委，孫初陽(yáng)，張曉楠，等. 一株基因 Ⅱ 型新城疫病毒的分離及基因組分析［J］. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2010 （3）:175-178.

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Molecular Characteristics and Pathogenicity of Newcastle Disease Virus from Domestic Ducks in China

WU Wei1， LIU Huai-ran2， LIU Sheng-wang1，2， CHEN Hong-yan1，2
（1. Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China； 2. State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology， Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150001， China）

ObjectiveTo study the molecular characteristics of Newcastle disease virus from domestic ducks， and then compare the pathogenicity in SPF chicken and ducks. MethodsBy cloning and sequencing the complete genomic sequence of Newcastle disease virus （NDV） strain Du/CH/LGD/ 358/2011， and then conducted the pathogenicity test in SPF chicken and ducks. ResultsThe genome was 15 198 nucleotides （nt） in length， followed the “rule of six” that is required for replication of NDV strains， and encoded six structural polypeptides. The cleavage motif of F protein was 112 ERQER/ L117， which was the characteristic of lentogenic strain. Phylogenetic analysis based on complete genomic sequences and partial sequences of F gene revealed that Du/CH/LGD/358/2011 belonged to class I genotype 3b， an independent clade closely related to Hong Kong LBM viruses. In addition， the pathogenic results between SPF chickens and SPF ducks was hardly varied. ConclusionDu/CH/LGD/ 358/2011 belonged to lentogenic strain， both SPF chicken and ducks could estimating be used fpr the pathogenicity. This study provided the theoretical basis for mornitoring on SPF ducks.

Newcastle disease virus； SPF duck； SPF chicken； Pathogenicity； Molecular characteristics

Q95-33

A

1674-5817（2015）01-0065-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.01.014

2014-12-08

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（201303033）

吳偉（1988-）， 男， 碩士研究生。E-mail: 709558484@qq.com

劉勝旺， 男， E-mail: swliu@hvri.ac.cn。陳洪巖， 男， E-mail: chenhongyan@caas.cn