陳獻(xiàn)花， 潘永明， 包一紅， 胡　飛， 龐秀炳， 陳　亮， 朱科燕， 徐劍欽， 陳民利

（1. 浙江省醫(yī)療器械檢驗院，杭州 310018； 2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗研究中心， 杭州 310053；3. 浙江微度醫(yī)療器械有限公司， 東陽 322118）

不同結(jié)扎血管夾在兔腹腔膽囊切除術(shù)中的應(yīng)用

陳獻(xiàn)花1， 潘永明2， 包一紅3， 胡飛1， 龐秀炳3， 陳亮2， 朱科燕2， 徐劍欽2， 陳民利2

（1. 浙江省醫(yī)療器械檢驗院，杭州 310018； 2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗研究中心， 杭州 310053；3. 浙江微度醫(yī)療器械有限公司， 東陽 322118）

目的觀察不同結(jié)扎血管夾在腹腔膽囊切除術(shù)后的結(jié)扎效果、炎癥反應(yīng)以及在體內(nèi)性能穩(wěn)定情況，為臨床應(yīng)用研究提供參考。方法將36只日本大耳白兔分成3組，即正常對照組、試驗組和同類產(chǎn)品對照（Hem-o-lok）組，每組12只，其中試驗組和同類產(chǎn)品對照組分別用佳助結(jié)扎血管夾和Hem-o-lok結(jié)扎夾在開腹膽囊摘除術(shù)中夾閉膽囊管及膽囊動脈。分別在術(shù)后6、12個月時處死動物，觀察結(jié)扎效果及結(jié)扎部位大體病變，并取血測定谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和肌酸激酶（CK）水平，同時取體內(nèi)的結(jié)扎血管夾進(jìn)行重量和特性粘度分析。結(jié)果術(shù)后試驗組和同類產(chǎn)品對照組結(jié)扎夾均在體內(nèi)結(jié)扎牢固，肝臟組織病理形態(tài)均無異常，未見出血或膽漏發(fā)生。與正常對照組比，試驗組和同類產(chǎn)品對照組血清GGT水平在術(shù)后3 d、14 d以及CK水平在術(shù)后3 d均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）； 此外，試驗組TNF-α水平在術(shù)后3 d和2個月時顯著降低，同類產(chǎn)品對照組TNF-α水平亦在術(shù)后6個月時顯著降低（P＜0.05）； 但實(shí)驗組血清GGT、TNF-α和CK水平與同類產(chǎn)品對照組比差異不顯著（P＞0.05）； 與原樣比較，體內(nèi)植入6個月、12個月后試驗組結(jié)扎血管夾和同類產(chǎn)品對照組Hem-o-lok結(jié)扎夾的重量和粘度均無明顯變化（P＞0.05）。結(jié)論佳助結(jié)扎血管夾用于夾閉膽囊管和血管結(jié)扎是有效的，在體內(nèi)性能穩(wěn)定，其作用效果和安全性與Hem-o-lok結(jié)扎夾類似。

結(jié)扎血管夾； 膽囊摘除術(shù)； 兔； 膽囊動脈

腹腔鏡膽囊切除術(shù)已成為當(dāng)前膽囊外科切除的金標(biāo)準(zhǔn)， 為確保膽囊管和膽囊動脈的安全， 牢固結(jié)扎膽囊管和膽囊動脈是避免術(shù)后膽漏、出血的關(guān)鍵環(huán)節(jié)， 故結(jié)扎管腔的安全性、可靠性及其術(shù)后的反應(yīng)性是當(dāng)前腹腔鏡外科關(guān)注的焦點(diǎn)。當(dāng)前腹腔鏡膽囊切除術(shù)中常采用鈦夾、可吸收夾及聚合物的不可吸收止血夾來閉合血管和膽管。鈦夾價格便宜， 但可能因夾閉不全而脫落或移位， 使其進(jìn)入膽管引起膽管炎、梗阻或結(jié)石形成； 另外， 鈦夾具有導(dǎo)電性， 若電凝器接觸時會引起組織燒傷， 對影像學(xué)檢查有潛在干擾等［1，2］?？晌招灾寡獖A雖安全性和可靠性好，但價格昂貴，最大只能夾閉10 mm寬的血管且不能夾閉組織束； 可降解的止血夾須在4 ℃左右冷藏。聚合物注塑的不可吸收止血夾不導(dǎo)電， 不會引起組織粘連或?qū)е陆桂瑁赏竂射線， 對CT、MRI等檢查無輻射、無偽影， 具有廣泛的實(shí)用性，使用效果和安全性已得到廣泛認(rèn)可［3-5］。我國在腹腔鏡膽囊切除術(shù)中使用的不可吸收結(jié)扎血管夾以進(jìn)口產(chǎn)品占據(jù)主導(dǎo)地位、價格昂貴。佳助結(jié)扎血管夾是由浙江微度醫(yī)療器械有限公司自主研制的新產(chǎn)品， 由人體不吸收的聚甲醛材料經(jīng)一次注塑而成。本實(shí)驗采用開腹手術(shù)下進(jìn)行兔膽囊摘除術(shù)， 使用佳助結(jié)扎血管夾進(jìn)行結(jié)扎， 初步觀察評價結(jié)扎血管夾對兔膽囊管和膽囊動脈的結(jié)扎效果和炎癥反應(yīng)情況、以及在體內(nèi)的性能穩(wěn)定性， 并與同類產(chǎn)品進(jìn)口Hem-o-lok結(jié)扎夾類比， 為進(jìn)一步進(jìn)行臨床應(yīng)用研究提供參考。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗動物

普通級日本大耳白兔36只， 體質(zhì)量為2.0～2.5 kg，雌雄各半，來源于新昌大市聚鎮(zhèn)欣健兔場［SCXK（浙）2010-0042］，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗研究中心普通級兔飼養(yǎng)室［SYXK（浙）2008- 0116］， 室內(nèi)溫度20～22 ℃， 相對濕度40%～70%， 飼喂全價營養(yǎng)顆粒飼料，自由飲水，12h/12h明暗交替。

1.2材料、試劑與儀器

佳助結(jié)扎血管夾（白色，WD-JZM型，批號：JY1004-1108001），浙江微度醫(yī)療器械有限公司研制；Hem-o-lok結(jié)扎夾（白色，L544240型，批號：01A1000481），美國威克公司生產(chǎn)；速眠新II注射液和鹿醒寧注射液均由吉林省華牧動物保健有限公司生產(chǎn)；鹽酸氯胺酮注射液，由福建古田藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；磷酸激酶（CK）試劑盒，購自上海申能德賽診斷技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子（TNF-α）ELISA檢測試劑盒，購自杭州達(dá)文生物有限公司；DU 800紫外分光光度計，美國Beckman公司；7020全自動生化分析儀，日本日立公司；Varioskan Flash連續(xù)光譜酶標(biāo)儀，芬蘭Thermo Fisher 公司。

1.3實(shí)驗方法

1.3.1分組和處理所有兔經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，空腹取耳中動脈血測定血液學(xué)和生化指標(biāo)，經(jīng)檢測無異常后，按體質(zhì)量隨機(jī)分成3組，即正常對照組、試驗（佳助）組和同類產(chǎn)品對照（Hem-o-lok）組，每組12只，雌雄各半，其中試驗組和同類產(chǎn)品對照組均行膽囊摘除術(shù)，并分別使用佳助結(jié)扎血管夾和Hem-o-lok結(jié)扎夾夾閉膽囊管和膽囊動脈，在術(shù)后6個月和12個月時各組均處理6只；正常對照組不做任何損傷處理。

1.3.2兔膽囊摘除術(shù)及結(jié)扎血管夾的應(yīng)用術(shù)前將實(shí)驗兔禁食12 h后，采用2 mg/kg速眠新II注射液和5 mg/kg氯胺酮注射液混合肌肉注射麻醉，待麻醉效果滿意后，仰臥固定于手術(shù)臺，消毒鋪巾并取前正中切口4 cm入腹。皮膚上拉肝臟暴露膽囊和膽囊三角，解剖膽囊三角并分離出膽囊管和膽囊動脈，在膽囊管及膽囊動脈的近心端和遠(yuǎn)心端使用結(jié)扎血管夾各1枚，切斷后銳性剝離膽囊并切除（圖1），觀察出血和膽汁漏出情況。術(shù)畢，分兩層縫合腹壁切口， 消毒， 肌注鹿醒寧注射液0.2 ml，觀察其一般情況尚可后，送回飼養(yǎng)室，并連續(xù)3 d肌肉注射青霉素鈉4×104U/只。

1.3.3一般情況及結(jié)扎部位觀察試驗期間觀察各組動物的體質(zhì)量、外觀體征、行為活動、傷口愈合情況、糞便與尿液以及飲食、飲水等情況，并在術(shù)后6個月和12個月時處死實(shí)驗兔，觀察結(jié)扎部位的大體變化，同時術(shù)后12個月取結(jié)扎部位的肝臟組織， 10%中性甲醛固定， 脫水、透明包埋和石蠟切片， 行HE染色， 觀察肝臟組織病變。

圖1　實(shí)驗兔膽囊管和膽囊動脈結(jié)扎示意圖Figure 1　Gallbladder duct and gallbladder artery ligation schematic in rabbits

1.3.4血清GGT、TNF-α和CK水平的測定分別在術(shù)前、術(shù)后3 d、7 d、14 d、1個月、2個月、4個月、6個月、9個月和12個月，空腹取耳中動脈血2 ml，3 000 r/min離心10 min，分離血清，在DU 800紫外分光光度計和7020全自動生化分析儀上分別測定血清GGT和CK水平，并用EILISA法在Thermo Varioskan Flash連續(xù)光譜酶標(biāo)儀上測定血清TNF-α水平。

1.3.5結(jié)扎血管夾重量和特性粘度分析術(shù)后6個月和12個月時處死動物后，取出結(jié)扎血管夾和Hem-o-lok結(jié)扎夾，進(jìn)行稱重和粘度分析測試，并與同批次的原樣比較。重量分析方法如下: 將樣品進(jìn)行清潔處理后瀝干表面水分，放入已經(jīng)60 ℃真空烘至恒重的稱量瓶（m0）中，于60℃真空烘干2 h后，取出冷卻稱重； 繼續(xù)放入真空干燥箱于同樣溫度烘干1 h后，取出冷卻稱重；如此反復(fù)操作，直至恒重（m）。特性粘度分析，采用烏氏粘度計，一點(diǎn)法測算特性粘度（intrinsic viscosity，［η］），溶劑為六氟異丙醇，溫度25±0.5℃。

2　結(jié)果

2.1術(shù)中結(jié)扎血管夾使用后的結(jié)扎效果

試驗組和同類產(chǎn)品對照組兔從開腹至膽囊切除術(shù)結(jié)束的手術(shù)時間一般在20～30 min， 平均25 min。術(shù)中試驗組和同類產(chǎn)品對照組實(shí)驗兔均無出血、膽漏和積液滲透等并發(fā)癥發(fā)生， 表明試驗血管結(jié)扎夾的結(jié)扎止血效果與Hem-o-lok結(jié)扎夾的作用無差異。

2.2術(shù)后各組實(shí)驗兔的一般情況觀察 實(shí)驗期間，正常對照組兔毛色光澤、精神行為活動良好，糞便呈球形或橢圓形，大小均勻且光潤，呈黑褐色，尿液呈黃色，飲食良好、體質(zhì)量持續(xù)增加；試驗組和同類產(chǎn)品對照組均在術(shù)后3 d內(nèi)食欲相對較差，體質(zhì)量有所減輕，且部分實(shí)驗兔糞便略有變細(xì)、小且干，但尿液、精神行為活動均未見明顯變化，切口部位未見明顯的感染化膿、裂開等發(fā)生； 術(shù)后7 d開始，實(shí)驗兔食欲明顯好轉(zhuǎn)，飼料無剩余， 糞便和尿液亦未見異常，且在術(shù)后1～2個月開始試驗組和同類產(chǎn)品對照組兔的體質(zhì)量已與正常對照組相當(dāng)。

圖2　術(shù)后6個月、12個月后各組實(shí)驗兔大體觀察Figure 2　The changes of gross lesion in each group of rabbit at 6 and 12 months postoperation

2.3血管結(jié)扎夾結(jié)扎部位大體及肝臟病理學(xué)觀察

大體觀察顯示，術(shù)后6個月和12個月時試驗組和同類產(chǎn)品對照組實(shí)驗兔的肝臟色澤均呈暗紅色，與正常對照組無異，且各組其余臟器均未見明顯的病理改變； 另外， 試驗組和同類產(chǎn)品對照組兔在術(shù)后6個月和12個月后夾閉部位的結(jié)扎血管夾和Hem-o-lok結(jié)扎夾均被一層薄薄的外周纖維組織膜包裹， 切面呈白色， 未見淤血塊形成， 夾閉部位相對較為牢固， 未見明顯的移位或脫落（圖2）。術(shù)后12個月肝臟組織病理學(xué)顯示，正常對照組肝細(xì)胞排列整齊， 體積正常， 小葉結(jié)構(gòu)完整； 試驗組和同類產(chǎn)品對照組兔的肝臟病理學(xué)亦未見明顯的異常改變（圖3）。

圖3　術(shù)后12個月各組實(shí)驗兔肝臟組織病理學(xué)觀察Figure 3　The pathological observation on liver tissue in each group of rabbit at 12 months postoperation

2.4各組血清GGT、TNF-α和CK水平的變化

正常對照組兔的血清GGT、TNF-α和CK水平均在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)不規(guī)則的小幅波動； 與正常對照組比， 試驗組血清GGT水平在術(shù)后3 d、14 d時和CK水平在術(shù)后3 d均明顯升高以及TNF-α水平在術(shù)后3 d、2個月時降低顯著（P＜0.05， P＜0.01）； 同類產(chǎn)品對照組血清GGT水平在術(shù)后3 d、14 d時和CK水平在術(shù)后3 d均明顯升高以及TNF-α水平亦在術(shù)后6個月時明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）； 但試驗組血清GGT、TNF-α和CK水平與同類產(chǎn)品對照組比均差異不顯著（P＞0.05）（圖4）。

2.5結(jié)扎血管夾重量和粘度分析

在體內(nèi)植入6個月和12個月后，與原樣比較，試驗組結(jié)扎血管夾和同類產(chǎn)品對照組Hem-o-lok結(jié)扎夾的重量和粘度均無明顯變化（表1）。

圖4　各組血清GGT、TNF-α和CK水平的變化Figure 4　The changes of serum GGT， TNF-α and CK levels in each group of rabbit

表1　各組結(jié)扎血管夾重量和粘度分析結(jié)果的變化Table 1　The changes of vascular ligating clips weight and its viscosity analysis result in each group

3　討論

微創(chuàng)外科手術(shù)中盡量減少手術(shù)對病人的創(chuàng)傷是外科醫(yī)生們所追求的共同目標(biāo)。在腹腔鏡膽囊切除術(shù)中，由于膽囊三角解剖不清，膽囊管粗大時使得處理十分困難，盡管有臨床學(xué)者采取多種手段改良［6，7］，以求盡可能減少創(chuàng)傷，但效果尚不理想，其關(guān)鍵問題是膽囊管的結(jié)扎。同時由于鈦夾不可伸縮性以及可吸收結(jié)扎血管夾的價格昂貴，且可吸收結(jié)扎血管夾的施夾器不能通過5 mm Trocar等等，均限制了這些產(chǎn)品在外科手術(shù)中應(yīng)用。而本研究的中號結(jié)扎血管夾可容納5～12 mm的組織，能完全滿足臨床膽囊三角的大束結(jié)扎， 并可承受800 mmHg的動脈壓力，對于高血壓患者也可安全使用。本結(jié)果顯示，直至術(shù)后12個月實(shí)驗兔體內(nèi)的結(jié)扎血管夾仍能牢固夾閉膽囊管和膽囊動脈，均未發(fā)現(xiàn)結(jié)扎血管夾滑脫移位、出血或膽漏等并發(fā)癥，同時術(shù)后實(shí)驗兔的肝臟亦未見明顯的病理改變；手術(shù)操作時間與Hem-o-lok結(jié)扎夾無明顯差異，且可達(dá)到同樣的效果，表明該結(jié)扎血管夾可應(yīng)用于膽囊切除術(shù)中，其操作簡單、方便，預(yù)后是安全、可靠的。此外，對在體內(nèi)結(jié)扎6個月和12個月的結(jié)扎血管夾進(jìn)行重量和粘度分析亦顯示其重量和粘度與原樣相比均未見明顯的變化，其反應(yīng)與同類產(chǎn)品對照Hem-o-lok結(jié)扎夾類似，進(jìn)一步表明該結(jié)扎血管夾在體內(nèi)的物理-化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，未見明顯的分子量衰減，確保結(jié)扎效果。

GGT作為一種糖蛋白，廣泛存在于機(jī)體的肝、腎、脾、腸、心肌和腦等組織器官中，從膽道排泄，血清中的GGT主要來自于肝臟，可作為評估肝功能異常的輔助指標(biāo)［8］。當(dāng)肝細(xì)胞受損時，使肝臟合成GGT增高。本結(jié)果顯示，在術(shù)后3～7 d試驗組和同類產(chǎn)品對照組血清GGT含量均明顯升高，而14 d后逐漸恢復(fù)并與正常對照組一樣維持相同的變化趨勢，故早期GGT升高與開腹膽囊切除術(shù)中對肝臟牽拉而引起輕微肝臟損傷有關(guān)，此后迅速恢復(fù)，這也與兔早期出現(xiàn)暫時性食欲下降和體質(zhì)量減輕，在術(shù)后7 d開始有明顯好轉(zhuǎn)并呈正常的增長模式的反應(yīng)是一致的，且其術(shù)后反應(yīng)與同類產(chǎn)品對照Hem-o-lok結(jié)扎夾類似，均未出現(xiàn)動物死亡等現(xiàn)象發(fā)生；另外，結(jié)果也顯示術(shù)后3 d實(shí)驗兔的CK出現(xiàn)暫時性的升高，由于CK主要存在于骨骼肌、腦和心肌組織中，CK的含量與肌肉運(yùn)動密切相關(guān)，而術(shù)后CK的暫時升高可能與手術(shù)引起的骨骼肌損傷或肌肉疲勞有一定的聯(lián)系，并在陽性對照組亦有類似的表現(xiàn)，且此后與正常對照組比均無明顯的差異，表明腹腔膽囊切除術(shù)后實(shí)驗兔恢復(fù)較快，證實(shí)本文試驗用結(jié)扎血管夾應(yīng)用后對動物的精神、行為活動等一般體征不會產(chǎn)生明顯的不適感，并對兔的肝功能、心肌酶代謝未造成明顯的影響，表明該結(jié)扎血管夾的應(yīng)用是可靠、安全的。TNF-α是由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌的一種重要的促炎細(xì)胞因子，也是炎癥反應(yīng)進(jìn)程中最早出現(xiàn)的重要炎癥介質(zhì)之一，其廣泛參與炎癥病變的多種病理生理變化， 對炎癥反應(yīng)、粒細(xì)胞的生成和功能均有重要影響， 能導(dǎo)致熱休克、低灌注， 還能介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的遷移和活化。本結(jié)果顯示， 試驗組和同類產(chǎn)品對照組血清TNF-α水平前期均低于正常對照組， 提示實(shí)驗兔術(shù)后未見明顯的炎癥反應(yīng)加劇，這可能與手術(shù)過程中采用小劑量的氯胺酮麻醉有一定的聯(lián)系， 有體外研究表明， 氯胺酮具有抑制炎性細(xì)胞因子的作用， 認(rèn)為小劑量氯胺酮可以直接干預(yù)炎癥反應(yīng)［9］， 并在敗血癥動物也觀察到可降低動物的死亡率以及減少TNF-α和IL-6的產(chǎn)生［10］， 而且直至整個實(shí)驗后期亦未見明顯的升高變化， 與正常對照組比均無明顯差異，進(jìn)一步表明試驗組結(jié)扎血管夾在體內(nèi)不會加劇炎性反應(yīng)， 具有很好的組織相容性。

可見，本研究中試驗組結(jié)扎血管夾能大束結(jié)扎膽囊管、膽囊動脈及周圍組織，有利于縮短手術(shù)時間，避免了周圍組織、肝臟膽管的撕拉和損傷，保證手術(shù)的安全性，有助于微創(chuàng)外科手術(shù)的優(yōu)化，減少腹腔鏡膽囊切除術(shù)后的不良反應(yīng)，促進(jìn)預(yù)后的恢復(fù)； 并且結(jié)扎血管夾在手術(shù)止血、安全性方面與Hem-o-lok結(jié)扎夾具有同樣的效果，故應(yīng)用于夾閉或結(jié)扎膽囊管和膽囊動脈是安全可靠的。

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Application of Different TypeVascular Ligating Clips on Laparoscopic Cholecystectomy in Rabbits

CHEN Xian-hua1， PAN Yong-ming2， BAO Yi-hong3， HU Fei1， PANG Xiu-bing3，CHEN Liang2， ZHU Ke-yan2， XU Jian-qin2， CHEN Min-li2
（1. Zhejiang Institute for the Control of Medical Device， Hangzhou 310018， China；2. Laboratory Animal Research Center， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China；3. Zhejiang Weidu Medical instrument Co.， Ltd.， Dongyang 322118， China）

ObjectiveTo provide an experimental basis for clinic application of vascular ligating clips on ligation effects， inflammation and its performance stability in vivo after cholecystectomy. Methods Thirty-six rabbits were divided into 3 groups， negative control group， experimental （Jiazhu） group and positive control （Hem-o-lok） group， 12 rabbits in each group. The gallbladder duct and gallbladder artery were closed by Jiazhu vascular ligating clips and Hem-o-lok clips in experimental group and positive control grouprespectively. Animals were euthanized at 6 and 12 months postoperation， the ligation effects and the gross lesion in ligation sites were observed， the serum GGT， TNF-α， CK levels and the vascular ligating clips weight as well as its intrinsic viscosity in vivo were also detected. Results The ligating clips were ligated firmly and no bleeding or bile leakage were found， and the pathological morphology of liver has also no abnormal in experimental group and positive control group. Compared with negtive control group， the serum GGT level in experimental group and Hem-o-lok group were significantly increased at 3 days and 14 days postoperation and CK level were also significantly increased at 3 days postoperation （P＜0.05， P＜0.01）. Furthermore， the TNF-α level was significantly decreased at 3 days and 2 months postoperation （P＜0.05）， and was also significantly decreased at 6 months postoperation in Hem-o-lok group （P＜0.05）. The serum GGT， TNF-α and CK levels were no significant differences between experimental group and Hem-o-lok group （P＞0.05）. Compared with original samples， the weight of ligating clips and its intrinsic viscosity in experimental group and Hem-o-lok group had no obvious changes after 6 and 12 months implanted （P＞0.05）. Conclusion It is effective for the ligation of gallbladder duct and gallbladder artery by Jiazhu vascular ligating clips， besides， its performance is stable in vivo. The Jiazhu vascular ligating clips are similar validity and securitywith Hem-o-lok clips.

Vascular ligating clips； Cholecystectomy； Rabbit； Gallbladder artery

R197-39Q95-33

A

1674-5817（2015）01-0046-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.01.010

2014-07-09

浙江省生物可降解醫(yī)用材料工程技術(shù)研究中心項目（2011E10021）； 浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項目

陳獻(xiàn)花（1968-）， 女， 副研究員， 研究方向: 醫(yī)療器械生物學(xué)評價。E-mail: chenxh.hz@163.com

陳民利（1963-）， 女， 教授， 研究方向: 實(shí)驗動物與比較醫(yī)學(xué)。E-mail: minlichen01@aliyun.com