劉　瑾，隋在云，侯文靜

（山東省中醫(yī)藥研究院， 濟(jì)南 250014）

應(yīng)用大鼠實(shí)驗(yàn)性痛經(jīng)模型評價(jià)痛經(jīng)停貼膏劑的鎮(zhèn)痛作用

劉瑾，隋在云，侯文靜

（山東省中醫(yī)藥研究院， 濟(jì)南 250014）

目的應(yīng)用大鼠實(shí)驗(yàn)性痛經(jīng)模型評價(jià)痛經(jīng)停貼膏劑的鎮(zhèn)痛作用，初步探討其治療痛經(jīng)的作用機(jī)制。方法制備大鼠痛經(jīng)模型，扭體法觀察不同劑量痛經(jīng)停貼膏劑對受試動物的鎮(zhèn)痛作用，ELISA法測定痛經(jīng)停貼膏劑對模型動物血漿6-酮-前列腺素1α（6-Keto-PGF1α）含量的影響。結(jié)果痛經(jīng)停貼膏劑對實(shí)驗(yàn)性痛經(jīng)大鼠具有明顯鎮(zhèn)痛作用，可明顯減少受試動物的扭體次數(shù)，延長潛伏期， 可使痛經(jīng)大鼠血漿6-keto-PGF1α含量明顯升高。結(jié)論痛經(jīng)停貼膏劑對催產(chǎn)素所致子宮劇烈收縮的痛經(jīng)大鼠有顯著的鎮(zhèn)痛作用， 其鎮(zhèn)痛機(jī)制與其對血漿6-keto-PGF1α水平的調(diào)節(jié)有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)性痛經(jīng)； 痛經(jīng)停貼膏劑； 扭體實(shí)驗(yàn)； 6-酮-前列腺素1α（6-Keto-PGF1α）； 大鼠

痛經(jīng)停貼膏劑是在臨床經(jīng)驗(yàn)方的基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代工藝制成的純中藥制劑，由具有揮發(fā)性組分的當(dāng)歸、吳茱萸、乳香、沒藥、肉桂、細(xì)辛、元胡、樟腦等藥物組成。經(jīng)大量臨床實(shí)踐和科研病例觀察， 本品具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)止痛之功效，對原發(fā)性痛經(jīng)患者具有很好的臨床療效。本研究旨在通過考察痛經(jīng)停貼膏劑對實(shí)驗(yàn)性痛經(jīng)模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用，評估其抗痛經(jīng)作用，并初步探討其治療痛經(jīng)的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動物分組與大鼠類痛經(jīng)模型制備

SPF級雌性Wistar大鼠，未孕，體質(zhì)量180～220 g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供［SCXK（魯）2009-0001］，實(shí)驗(yàn)前用寵物電推剪將大鼠腹部神闕穴處皮膚脫毛，面積約為4 cm2，將大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分成空白對照組、模型對照組、痛經(jīng)停貼膏劑高、中、低劑量組，共5組，每組10只。參考文獻(xiàn)［1］方法制備大鼠類痛經(jīng)模型： 除空白對照組外，其余各組大鼠連續(xù)灌服戊酸雌二醇片（補(bǔ)佳樂，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司分裝， 批號： 065A）10 d（第1日、第10日每日灌胃給藥2.5 mg/kg其余8日均1 mg/kg）。

1.2給藥方法

從灌服給予戊酸雌二醇片第7日起， 痛經(jīng)停貼膏劑高劑量（0.566 g生藥/cm2）、中劑量（0.283 g生藥/cm2）、低劑量（0.141 g生藥/cm2）組分別將藥物涂抹在敷料布上，然后貼在大鼠腹部神闕穴處（神闕穴定位： 根據(jù)類比原理， 在大鼠胸腹正中線胸骨柄上緣至外生殖器連線上3/4與下1/4交界點(diǎn)取之［2］），用白膠布固定?？瞻讓φ战M和模型對照組給予空白基質(zhì)貼敷，每日1次，連續(xù)給藥6 d。

1.3縮宮素扭體試驗(yàn)

各組于末次給藥1 h后， 腹腔注射縮宮素2 U/只，立即秒表計(jì)時(shí)， 以扭體反應(yīng)（大鼠腹部收縮內(nèi)凹， 軀干與后肢伸展， 臀部與一側(cè)肢體內(nèi)旋）為子宮收縮痛經(jīng)指標(biāo)（注： 不發(fā)生扭體反應(yīng)大鼠的潛伏期按30 min計(jì)）。觀察并記錄大鼠出現(xiàn)疼痛的時(shí)間（潛伏期）及30 min內(nèi)的扭體次數(shù)，計(jì)算扭體抑制率。

扭體抑制率=［（模型對照組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù)）/模型對照組扭體次數(shù)］×100%

1.4大鼠血漿前列環(huán)素（PGI2）含量測定（測定其代謝產(chǎn)物6-keto-PGF1α來表示）

各組于催產(chǎn)素扭體試驗(yàn)結(jié)束后，腹腔注射體積分?jǐn)?shù)3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉大鼠，經(jīng)大鼠腹主動脈取血， 肝素抗凝， 3 000 r/min 離心15 min，分離血漿，采用雙抗體夾心ELISA法，按試劑盒操作說明進(jìn)行血漿PGI2的代謝產(chǎn)物6-酮-前列腺素1α（6-Keto-PGF1α）含量測定。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1　痛經(jīng)停貼膏劑對縮宮素誘發(fā)大鼠痛經(jīng)的影響

2　結(jié)果

2.1痛經(jīng)停貼膏劑對縮宮素誘發(fā)大鼠痛經(jīng)的影響

由表1結(jié)果可見，與空白對照組比較，模型對照組大鼠扭體反應(yīng)的潛伏期明顯縮短，30 min內(nèi)的扭體次數(shù)明顯增加，表明縮宮素作用于子宮引起的強(qiáng)烈宮縮可以引起大鼠產(chǎn)生腹痛，發(fā)生扭體反應(yīng)，提示大鼠類痛經(jīng)模型復(fù)制成功。與模型對照組比較，痛經(jīng)停貼膏劑中、高劑量組大鼠扭體反應(yīng)的潛伏期明顯延長，高劑量組大鼠30 min內(nèi)的扭體次數(shù)明顯減少，提示痛經(jīng)停貼膏劑對縮宮素誘發(fā)的大鼠痛經(jīng)具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。

2.2痛經(jīng)停貼膏劑對縮宮素誘發(fā)痛經(jīng)大鼠血漿6-keto-PGF1α含量的影響

由表2結(jié)果可見， 與空白對照組比較， 模型對照組大鼠血漿6-keto-PGF1α含量明顯降低。痛經(jīng)停貼膏劑中、高劑量組血漿6-keto-PGF1α含量均明顯升高， 與模型對照組比較差異具有顯著性（P＜0.05，P＜0.01），提示： 痛經(jīng)停貼膏劑能升高痛經(jīng)模型大鼠的6-keto-PGF1α含量，從而達(dá)到鎮(zhèn)痛效果。

表2　痛經(jīng)停貼膏劑對痛經(jīng)大鼠血漿6-keto-PGF1α含量的影響

3　討論

3.1實(shí)驗(yàn)性痛經(jīng)模型的選擇

近年來用于制備痛經(jīng)模型的動物包括豚鼠、SD大鼠、Wistar大鼠、兔及小鼠，其中以Wistar大鼠使用率為最高。Wistar大鼠因性周期較其它動物穩(wěn)定，故在研究原發(fā)性痛經(jīng)的動物實(shí)驗(yàn)中常常被選用，本研究選取Wistar大鼠。

作者采用腹腔注射縮宮素引起子宮平滑肌痙攣性收縮這一較為公認(rèn)的在體子宮痙攣（類痛經(jīng)反應(yīng)）的病理模型［3］。造模及動物處理參考林喬等［1］的方法，造模使用藥物為戊酸雌二醇和縮宮素。戊酸雌二醇為天然雌二醇的戊酸鹽，具有雌二醇的藥理作用，可增強(qiáng)子宮收縮，提高子宮的敏感性?？s宮素為制備痛經(jīng)模型時(shí)經(jīng)常使用的致痛藥物，不僅因?yàn)槠淇梢灾苯幼饔糜谧訉m肌細(xì)胞引起子宮收縮，而且還可以同時(shí)刺激子宮內(nèi)膜細(xì)胞釋放PGF2α引起痛經(jīng)［4］。大鼠急性痛經(jīng)模型制備周期有的為4 d，有的為10 d。有研究表明，大鼠急性痛經(jīng)模型建立時(shí)間以10～15 d為宜［5］。故本研究采用了10 d方案以提高大鼠子宮的敏感度。

3.2痛經(jīng)停貼膏劑鎮(zhèn)痛作用與血漿PGI2水平

痛經(jīng)疼痛嚴(yán)重影響患者的學(xué)習(xí)、工作和生活，因此止痛成為首要任務(wù)。本實(shí)驗(yàn)中作者在給大鼠戊酸雌二醇溶液灌胃后， 腹腔注射縮宮素， 大鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)，這是大鼠子宮平滑肌痙攣、疼痛的外在反應(yīng)和客觀評價(jià)方法之一，扭體潛伏期和扭體次數(shù)能夠客觀反應(yīng)大鼠給予縮宮素后所致痛經(jīng)的情況。

近年來的研究認(rèn)為，原發(fā)性痛經(jīng)的發(fā)病與前列腺素（PG）密切相關(guān)。PG在體內(nèi)合成中有多種代謝物，目前認(rèn)為與疼痛有關(guān)的主要是PGF2α、PGE2、PGI2、TXA2［6］。PGF2α可使子宮張力升高，子宮過度收縮甚至痙攣性收縮而導(dǎo)致痛經(jīng)。TXA2主要來自血小板，有較強(qiáng)的子宮收縮作用，強(qiáng)力促進(jìn)血小板凝聚及血栓形成。PGE2可松馳子宮平滑肌。PGI2是一個(gè)強(qiáng)有力的血小板聚集抑制劑和血管擴(kuò)張劑，它可涉及子宮血流動力學(xué)的調(diào)控，降低PGF2α誘導(dǎo)的肌緊張度。同時(shí)PGI2和TXA2是一對既相互拮抗又相互調(diào)節(jié)的前列腺素，特別是對血管舒縮或血小板聚散活性有強(qiáng)烈的調(diào)控作用。血漿或組織中TXA2和PGl2平衡失調(diào)是造成血小板聚集， 血管痙攣收縮或血栓形成的原因之一。正常情況下， 血小板表面激活后產(chǎn)生的花生四烯酸在環(huán)氧合酶的作用下生成PGI2和TXA2， 二者在循環(huán)中的水平處于相對平衡狀態(tài)， 共同調(diào)節(jié)機(jī)體微循環(huán)和血流動力學(xué)功能。鑒于實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)所限， 本研究只選擇PGI2作為觀測指標(biāo)。而PGI2在體內(nèi)半衰期極短， 為2～3 min。由于PGI2的不穩(wěn)定性， 目前還難以直接測定， 所以國內(nèi)外均以測定其穩(wěn)定無活性的代謝產(chǎn)物6-keto-PGF1α作為判斷其濃度的指標(biāo)綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用較為公認(rèn)的腹腔注射縮宮素引起大鼠類痛經(jīng)反應(yīng)的病理模型，評價(jià)了痛經(jīng)停貼膏劑的鎮(zhèn)痛作用，并初步探討了其治療痛經(jīng)的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，痛經(jīng)停貼膏劑中高劑量組能延長大鼠扭體反應(yīng)潛伏期，高劑量組能減少大鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，能夠明顯提高大鼠血漿6-keto-PGF1α水平，說明痛經(jīng)停貼膏劑可以抑制大鼠扭體反應(yīng)，具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛作用機(jī)制可能與提高血漿PGI2水平有關(guān)。

［1］林喬， 陳建南， 賴小平， 等. 川芎提取物對實(shí)驗(yàn)性痛經(jīng)的鎮(zhèn)痛機(jī)制［J］. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2011， 17（10）：161.

［2］中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會. 中國獸醫(yī)針灸學(xué)［M］. 北京： 農(nóng)業(yè)出版社， 1984：213.

［3］劉敏如， 譚萬信. 中醫(yī)婦產(chǎn)科學(xué)［M］. 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 2001：323.

［4］嵇波， 張露芬， 朱江， 等. 痛經(jīng)模型建立和評價(jià)方法的思考［J］. 中國藥理學(xué)通報(bào)， 2008， 24（6）：711.

［5］孫海燕， 曹永孝， 劉靜， 等. 小鼠痛經(jīng)模型的建立［J］. 中國藥理學(xué)通報(bào)， 2002， 18（2）：233.

［6］傅金榮. 子宮內(nèi)膜異位癥致疼痛的研究概況［J］. 上海中醫(yī)藥雜志， 1997， （6）：16.

Evaluation on Analgesic Effect of Tongjingting Paste in Rats Model with Experimental Dysmenorrhea

LIU Jin， SUI Zai-yun， HOU Wen-jing
（Shandong Academy of Chinese Medicine， Jinan 250014， China）

ObjectiveTo evaluate the analgesic effect of tongjingting paste in rats model with experimental dysmenorrhea and to reveal its analgesic mechanism. MethodsThe experimental dysmenorrheal model in rats was induced with oxytocin. A writhing test was employed to evaluate the analgesic effects of tongjingting paste， which was designed into different doses， in animal subjects. The contents of 6-keto-PGF1α in the blood plasma were observed by ELISA assay. ResultsTongjingting paste has a significant analgesic effect on experimental dysmenorrheal model in rats. Latent period was delayed significantly， the number of writhing response was evidently decreased as well. Besides， 6-keto-PGF1|á were significantly increased in the treated groups. ConclusionTongjingting paste had a significant analgesic effect on experimental dysmenorrheal model in rats. Its analgesic mechanism may be mediated by regulating the plasma levels of 6-keto-PGF1α.

Tongjingting paste； Experimental dysmenorrheal； Writhing reaction； 6-keto-PGF1α； Rat

Q95-33

B

1674-5817（2015）02-0167-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.02.016

2014-06-30

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（No. 2011-165）

劉瑾（1973-）， 女， 碩士， 副研究員， 主要從事中藥復(fù)方藥效作用機(jī)理及安全性評價(jià)工作。E-mail： jinanlj56@163.com

隋在云（1964-）， 女， 碩士， 研究員， 主要從事中藥及其有效成分的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及安全性評價(jià)工作。E-mail： zy_505@163.com