袁　征， 張　璐， 武文卿， 袁子彥， 趙善民， 余琛琳， 林麗芳， 湯　球

（1. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院科技部條件處，北京 100036；2. 第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，上海200433）

側(cè)腦室注射4，4'-二異硫氰基芪-2，2'-二磺酸對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響

袁征1， 張璐2， 武文卿1， 袁子彥2， 趙善民2， 余琛琳2， 林麗芳2， 湯球2

（1. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院科技部條件處，北京 100036；2. 第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，上海200433）

目的探討側(cè)腦室注射4，4'-二異硫氰基芪-2，2'-二磺酸（DIDS）對腦缺血再灌注（CIRI）大鼠腦組織損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法采用線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞（MCAO）模型，側(cè)腦室注射法給藥。腦缺血2 h再灌注24 h后用Zea-Longa標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評分； 紅四氮唑溶液（TTC）染色法測定大鼠腦梗死面積； Western blot法測大鼠腦組織B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）和天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）兩種蛋白的表達(dá)水平； 試劑盒測定大鼠腦組織內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的活性。結(jié)果100 μmol/L DIDS側(cè)腦室給藥能改善大腦的神經(jīng)功能，減少腦缺血面積，增加Bcl-2的表達(dá)，減少Caspase-3的表達(dá)，降低iNOS的活性。結(jié)論DIDS可以通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)以及降低iNOS的活性對大鼠神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)，減輕腦缺血再灌注損傷（CIRI）造成的腦組織損傷。

缺血再灌注損傷（CIRI）； 側(cè)腦室注射； 4，4'-二異硫氰基芪-2，2'-二磺酸（DIDS）；B淋巴細(xì)胞瘤（Bcl-2）； 天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）； 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）

臨床上，對缺血性腦病采取的通常治療方案是溶栓恢復(fù)腦血流。但缺血后的腦血流恢復(fù)在某些情況下會引起腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemiareperfusion injury， CIRI），導(dǎo)致大腦功能難以恢復(fù)，并且加重了神經(jīng)元的凋亡和腦組織結(jié)構(gòu)損傷［1］。CIRI是一個復(fù)雜的快速級聯(lián)反應(yīng)的病理生理過程，包括能量障礙、氧化損傷、興奮性氨基酸毒性凋亡基因的激活等。這些環(huán)節(jié)相互關(guān)聯(lián)最終使得細(xì)胞凋亡或壞死［2］。因此，對CIRI的機(jī)制及治療研究一直受到較大關(guān)注。

4，4'-二異硫氰基芪-2，2'-二磺酸（4，4'-diisothiocyanostibibene-2，2'-disufonic acid，DIDS）是非特異性氯離子通道阻斷劑。有研究表明［3］， DIDS能夠保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、抑制大鼠心臟缺血再灌注損傷并對心臟進(jìn)行保護(hù)。由于DIDS分子量較大， 不易透過血腦屏障，因此本實驗采用大鼠腦缺血再灌注（ischemia-reperfusion， I/R）模型， 觀察側(cè)腦室注射DIDS對缺血2 h后再灌注的大鼠神經(jīng)功能評分和缺血梗死體積的影響， 以及對大鼠腦組織中B淋巴細(xì)胞瘤（Bcl-2）、天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表達(dá)情況和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性的影響， 為CIRI的治療提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～280 g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供［SCXK（滬）2008-0016］，飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心屏障設(shè)施［SYXK（滬）2012-0003］，飼養(yǎng)1周使其適應(yīng)環(huán)境后進(jìn)行實驗。

1.2主要儀器與試劑

ALC-H電動數(shù)顯動物腦立體定向儀、ALCIP600型微量注射泵、ALC-CED8型動物顱骨鉆（以上均由上海奧爾科特生物科技有限公司生產(chǎn)），低溫離心機(jī)（22R Centrifuge，Beckman）。DIDS、兔抗大鼠Caspase-3抗體（Sigma公司）； 兔抗大鼠Bcl-2抗體（Santa Cruz公司）； SDS-PAGE凝膠試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；iNOS測定試劑盒及GSH-PX測定試劑盒（南京建成生物工程公司）。

1.3大鼠局灶性I/R模型的制備

參照Longa線栓法［4］制作大腦中動脈栓塞（MCAO）模型。大鼠稱重，體積分?jǐn)?shù)3%戊巴比妥鈉溶液（1.2 mL/kg）腹腔注射麻醉。仰臥固定，頸部正中消毒后做一約3 cm縱切口，找到一側(cè)頸總動脈（CCA），向上游離至頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA）分叉處。結(jié)扎ECA的分支及其末支，分離結(jié)扎ICA的顱外分支。動脈夾夾閉CCA和ICA，在ECA殘端距CCA分支約3 mm處剪一小口，自ECA向CCA分支插入直徑為0.24 mm的尼龍線，進(jìn)入ICA， 取下ICA上動脈夾， 尼龍線沿ICA顱內(nèi)走向緩緩?fù)七M(jìn)， 直至遇到阻力時進(jìn)入深度約17.5 ～20 mm，將尼龍線與ECA殘端一同結(jié)扎，松開CCA，外留約2 cm線頭，縫合皮膚，切口消毒。缺血2 h后，將尼龍線輕輕退出，形成I/R模型。術(shù)中室溫保持在22～25 ℃，同時應(yīng)避免反復(fù)插線（圖1）。本實驗在模型成功后分組，共制模139只，成功96只。

1.4側(cè)腦室注射方法

大鼠腦缺血模型制備后，補(bǔ)1/3劑量麻醉藥，頭頂部剃毛，固定于腦立體定向儀，參照優(yōu)化的側(cè)腦室埋管方法［5］，消毒后沿頂部正中線切開皮膚，剝離筋膜，暴露前囟（Bregma），根據(jù)諸葛啟釧［6］等所譯《大鼠腦立體定位圖譜》選擇側(cè)腦室定位坐標(biāo)為前囟后1.30 mm，矢狀縫旁開1.70 mm用顱骨鉆鉆孔，注射針進(jìn)至腦膜下3.50 mm，加一極小正壓無阻力感則正確進(jìn)入側(cè)腦室，若有阻力感，則上下稍作調(diào)整，直至無阻力感，此方法可保證側(cè)腦室注射成功率達(dá)100%。開啟微量注射泵以0.5 μL/min的速度注射5 μL相應(yīng)試劑。注射后靜置10 min，抽出注射針，縫合皮膚切口（圖1）

1.5實驗分組與處理

96只大鼠， 隨機(jī)分組。其中48只分為6組： 假手術(shù)組（Sham）、模型組（I/R）、模型+側(cè)腦室注射生理鹽水對照組（I/R+NS）、模型+側(cè)腦室注射DIDS高、中、低劑量（分別為50 μmol/L、100 μmol/L 和200 μmol/L）組（I/R+DIDS-L、I/R+DIDS-M，I/R+DIDS-H）， 每組各8只， 神經(jīng)功能評分完畢后用于測定腦梗死面積。另24只分為3組： 假手術(shù)組（Sham）模型+側(cè)腦室注射生理鹽水對照組（I/R+NS）、模型+側(cè)腦室注射DIDS 100 μmol/L給藥組（I/R+DIDS）（經(jīng)藥效學(xué)證實該劑量為DIDS的最小有效劑量，以該劑量來研究DIDS對腦缺血再灌注的影響），每組各8只，用于Bcl-2、Caspase-3蛋白的表達(dá)水平檢測剩余24只再分為3組： 假手術(shù)組（Sham）、模型+側(cè)腦室注射生理鹽水對照組（I/R+NS）、模型+側(cè)腦室注射DIDS 100 μmol/L（I/R+DIDS）給藥組，每組各8只，用于iNOS和GSH-PX活性測定。

圖1　大鼠MCAO模型制作和側(cè)腦室注射

1.6檢測指標(biāo)

1.6.1神經(jīng)功能評分依照Longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)，于再灌注24 h對每只大鼠評分。評分標(biāo)準(zhǔn)為： 0分，正常，無神經(jīng)損傷癥狀； 1分，提起尾巴，缺血對側(cè)前肢不能完全伸直； 2分，在1分的基礎(chǔ)上向缺血對側(cè)轉(zhuǎn)圈； 3分，僅能繞原點向缺血對側(cè)轉(zhuǎn)圈；4分，完全不能支撐身體重量，僅能躺向缺血對側(cè)，無任何自發(fā)活動。評分過程由至少由兩人參與完成。

1.6.2腦梗死面積測定缺血2 h再灌注24 h，將大鼠過量麻醉處死后取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，剩余部分均分切為厚度基本相同的5份冠狀腦片，放入2%紅四氮唑溶液（TTC）中，避光，37 ℃孵育30 min，拍照，用圖像分析軟件Imagepro Plus 6.0分析梗死面積占全腦面積的百分比。

1.6.3Western blot測定Bcl-2、Caspase-3蛋白的表達(dá)缺血2 h再灌注24 h，將大鼠過量麻醉后斷頭取腦。置于冰上迅速分離缺血皮質(zhì)和海馬，冰生理鹽水漂洗去除血液，進(jìn)行總蛋白提取，使用BCA （bicinchoninic acid）蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量， 制備蛋白樣品。樣品加入5×的上樣緩沖液， 100 ℃煮沸10～15 min，按蛋白上樣量15 μg上樣。SDSPAGE濃縮膠為5%， 分離膠為12%。電泳： 分離膠為80 V， 45 min，濃縮膠為120 V， 80 min， 上樣緩沖液跑到膠的底部時停止電泳。轉(zhuǎn)膜： 100 V， 60 min。脫脂牛奶封閉2 h，一抗分別用Bcl-2（1∶1000），Caspase-3（1∶2 000）， 4 ℃過夜， 用TBST搖床震蕩洗滌3次，每次5 min。二抗采用HRP-羊抗兔IgG （1∶5 000），37 ℃孵育2 h， 用TBST搖床震蕩洗滌3次， TBS震蕩洗滌3次。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ELC）顯色。曝光后采用全自動數(shù)碼成像系統(tǒng)掃描分析靶蛋白條帶，以Sham組灰度值為1，I/R+NS組和DIDS給藥組的灰度值與Sham組灰度值的比值作為Bcl-2、Caspase-3的相對表達(dá)水平。

1.6.4iNOS和GSH-PX活性檢測缺血2 h再灌注24 h， 將大鼠過量麻醉處死后取腦， 置于冰上迅速分離缺血皮質(zhì)和海馬， 冰生理鹽水漂洗去除血液，制成10%生理鹽水組織勻漿。取一部分組織勻漿檢測iNOS活性：將組織勻漿離心（3 000 r/min）10 min，取上清稀釋10倍后測定蛋白濃度， 依照南京建成生物工程公司試劑盒說明書測定iNOS活性。取剩余組織勻漿檢測GSH-PX活性： 將組織勻漿離心（4 ℃，1 300 r/min） 10 min， 取上清稀釋10倍， 測定蛋白濃度，依照南京建成生物工程公司試劑盒說明書測定GSH-PX活性。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，用Mann-Whitney檢驗來比較蛋白質(zhì)印跡和神經(jīng)行為功能評分的差異；組間差異比較用ANOVA方法分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評分、腦梗面積

大鼠腦缺血2 h再灌注24 h后，與I/R組的神經(jīng)功能評分、梗死范圍相比（表1）： I/R+NS 組未見明顯減少（P＞0.05）； Sham組、I/R+DIDS-M組、I/R+DIDS-H組明顯減少（P＜0.01）。但I(xiàn)/R+DIDS-M組與I/R+DIDS-H組的神經(jīng)評分、梗死范圍相比則無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

表1　側(cè)腦室注射DIDS對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評分、腦梗面積的影響

2.2腦內(nèi)Bcl-2、Caspase-3表達(dá)

大鼠腦缺血2 h， 再灌注24 h后， 腦內(nèi)缺血組織中Bcl-2的表達(dá)量：I/R+NS組比Sham組略升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義；I/R+DIDS組比I/R+NS組明顯升高（P＜0.05，圖2和表2）。Caspase-3的表達(dá)量：I/R+NS組比Sham組明顯升高（P＜0.01），I/R+DIDS組比I/R+NS組則顯著減少（P＜0.01，圖2和表2）。

圖2　DIDS對大鼠缺血腦組織Bcl-2、Caspase-3表達(dá)的影響

表2　DIDS（100 μmol·L-1）對腦缺血再灌注大鼠Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)和iNOS、GSH-PX活性的影響

2.3對腦內(nèi)iNOS和GSH-PX活性的影響

大鼠腦缺血2 h， 再灌注24 h后，iNOS活性I/R+NS組明顯高于Sham組（P＜0.01）， 而I/R+DIDS組低于I/R+NS組（P＜0.05，表2）； I/R+DIDS組的GSH-PX活性雖有升高但與 Sham、I/R+NS兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3　討論

CIRI是多因素互相作用的結(jié)果，其形成機(jī)制包括跨膜的離子流動、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基的形成、興奮性氨基酸的毒性作用、過氧化物的產(chǎn)生、線粒體功能失調(diào)、炎癥反應(yīng)介質(zhì)的釋放、血腦屏障損傷等多個方面［7］。近年來對針對CIRI的各種機(jī)制進(jìn)行了多環(huán)節(jié)多靶點的治療探索，其中神經(jīng)功能保護(hù)的研究是CIRI治療研究中的一個重要環(huán)節(jié)。有研究顯示［8，9］，神經(jīng)細(xì)胞的凋亡與一些特殊的離子流有關(guān)。氯離子通道廣泛分布于動物體內(nèi)各組織器官，并且氯離子作為體內(nèi)含量最多的陰離子其對于細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)有至關(guān)重要的作用。有研究表明［3，10-13］，氯離子通道通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的陽離子通道引起神經(jīng)細(xì)胞的容積改變，導(dǎo)致其凋亡，并且在心臟缺血再灌注損傷中使用氯離子阻滯劑能夠?qū)π募〖?xì)胞進(jìn)行保護(hù)。

DIDS是一個非特異性氯離子通道阻斷劑，能抑制細(xì)胞凋亡，有研究顯示其對心肌細(xì)胞的缺血再灌注損傷起到抑制作用［3］。由于DIDS分子量較大，不易透過血腦屏障，因此本實驗中通過側(cè)腦室注射的方法給藥，研究DIDS這種氯離子通道阻滯劑對大鼠CIRI的影響。

CIRI中神經(jīng)細(xì)胞凋亡的異常增加是其死亡的主要形式［2］。Bcl-2與Caspase-3是CIRI中重要的凋亡調(diào)控基因蛋白。Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡， 而Caspase-3則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本實驗結(jié)果表明，DIDS能顯著提高缺血腦組織的Bcl-2表達(dá)并降低Caspase-3表達(dá)，這提示DIDS在腦組織缺血狀態(tài)下能夠通過阻滯氯離子通道上調(diào)抗凋亡蛋白，下調(diào)凋亡蛋白，從而減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的效果

腦缺血再灌注后期組織損傷和免疫反應(yīng)誘導(dǎo)多種細(xì)胞合成 iNOS并激活其活性， 持續(xù)產(chǎn)生大量 NO，NO在體內(nèi)可與超氧陰離子快速結(jié)合生成另一種強(qiáng)氧化劑過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite， ONOO-）ONOO-可以抑制細(xì)胞電子傳遞鏈中的多個復(fù)合物并且是線粒體順烏頭酸酶強(qiáng)有力的抑制劑。迅速降低升高的NO水平，可很大程度上保護(hù)腦缺血后的神經(jīng)元［14-16］。GSH-PX是一種重要的一線抗氧化酶能夠消除由于腦缺血而產(chǎn)生的大量氧自由基的毒性作用［17］，從而對細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)。本實驗顯示DIDS能夠降低CIRI中iNOS的活性，但是對GSH-PX的活性未見明顯影響，提示DIDS能夠通過減少細(xì)胞的凋亡損傷而減少iNOS的激活，進(jìn)一步減弱缺血再灌注對大鼠腦組織造成的損傷。

對CIRI多環(huán)節(jié)多層面的研究有助于臨床對缺血性腦血管疾病的治療，本實驗通過側(cè)腦室給藥的直觀研究表明DIDS能夠?qū)IRI中的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)，顯著減少其凋亡。但是對于給藥時間、給藥方式（神經(jīng)科學(xué)臨床應(yīng)用中有側(cè)腦室穿刺、引流、置換等方式）還需要進(jìn)一步的研究，以期對臨床提供更加有效的實驗數(shù)據(jù)。

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Protective Effects and Mechanisms of 4，4'-diisothiocyanostibibene-2，2'-disulfonic Acid Injected by Intarcerebroventricular against Cerebral Ischemia-reperfusion Injury Rat

YUAN Zheng1， ZHANG Lu2， WU Wen-qing1， YUAN Zi-yan2，ZHAO Shan-min2， YU Chen-lin2， LIN Li-fang2， TANG Qiu2
（1. Support Division， Department of Science and Technology， Academy of Military Medical Sciences， Beijing 10036， China； 2. Laboratory Animal Center， Second Military Medical University， Shanghai 200433， China）

ObjectiveTo explore the protective effects and mechanisms of 4，4'-diisothiocyanostibibene-2，2'-disulfonic acid （DIDS） injected by intarcerebroventricular against cerebral ischemia-reperfusion injury （CIRI） in middle cerebral artery occlusive （MCAO） rats. MethodsFocal cerebral ischemia in rats was produced by 2 h occlusion of the middle cerebral artery and 24 h reperfusion. DIDS and normal saline （NS） was injected by intarcerebroventricular. The neurologic deficit scores were investigated according to Zea-Longa's Standard. The infarct areas were assessed with software Imagepro Plus 6.0 after TTC staining. The levels of Bcl-2 and Caspase-3 in central neutral system were assessed by western blot. And the activities of inducible nitric oxide synthase （iNOS） as well as glutathione peroxidase （GSH-PX） were determined by specific kit. ResultsDIDS （100 μmol/L） could decrease the neurologic deficit score， reduced the infarct areas of the brain in CIRI rats， enhance the expression of Bcl-2，depresse the expression of Caspase-3， and decrease the activity of iNOS. ConclusionDIDS has a protective effect on CIRI of rat and this effect is related to enhancing the expression of Bcl-2 and diminishing Caspase-3 expression， decreasing the activity of iNOS.

Cerebral ischemia-reperfusion injury （CIRI）； Intracerebroventricular injection； DIDS； Bcl-2；Caspase-3； Inducible nitric oxide （iNOS） synthase； Glutathione peroxidase （GSH-PX）

Q95-33

A

1674-5817（2015）02-0092-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.02.002

2014-11-12

上海市科委發(fā)展基金（121409009700）

袁征（1973-）， 男， 實驗師。E-mail： yuanzheng001@126.com

湯球（1971-）， 男， 副教授。E-mail： 13764548588@163.com