陳　亮，潘永明，蔡月琴，朱科燕，徐孝平，陳民利

（浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心，比較醫(yī)學研究中心，杭州 310053）

VAP血管通路在小型豬靜脈糖耐量試驗中的應用

陳亮，潘永明，蔡月琴，朱科燕，徐孝平，陳民利

（浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心，比較醫(yī)學研究中心，杭州 310053）

目的通過VAP（vascular-access-port）血管通路來改善小型豬靜脈糖耐量試驗（IVGTT）結果的可靠性，減少試驗過程中的應激反應，并且為小型豬IVGTT試驗提供一種便捷快速且穩(wěn)定的新方法。方法將12只巴馬小型豬隨機分為VAP血管通路植入組與正常對照組，比較兩組動物在IVGTT中的差異，并評價應激指標。結果VAP組與對照組小型豬在IVGTT試驗中均能出現糖耐量反應，其血清胰島素含量變化以及趨勢無統(tǒng)計學差異，但VAP組血糖水平在0 min，60 min、90 min以及120 min顯著低于對照組（P＜0.05， P＜0.01），且在5 min血糖水平顯著高于正常對照組（P＜0.01）； 對照組肌酶激酶（CK）水平在各時間點均顯著高于VAP組（P＜0.01）； 對照組促腎上腺皮質激素（ACTH）、皮質醇（CORT）在0 min、15～120 min時都高于VAP組，且在60～120 min時差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05， P＜0.01）。結論與常規(guī)方法比較，VAP血管通路植入后小型豬在IVGTT中所受應激更小，更符合動物福利，且試驗結果更加可靠穩(wěn)定。

VAP（vascular-access-port）血管通路； 小型豬； 靜脈糖耐量試驗（IVGTT）； 應激

近年來國內、外使用小型豬作為糖尿病實驗動物模型的越來越多，主要是由于小型豬與人類的功能器官很接近，胰島素肽鏈氨基酸的組成和人類最相近［1］，心血管系統(tǒng)形態(tài)結構和生理特征與人類差異很小，而且豬與人類一樣都是雜食性動物，自身的糖代謝、脂代謝的特點也極為相似［2，3］，因此小型豬作為誘導糖尿病動物模型相比于其他動物有獨特的優(yōu)勢，而且價格也相對適中，是研究人類糖代謝異常的理想模型動物。根據2010年美國糖尿病協(xié)會發(fā)布了人類糖尿病診斷的新標準［4］，糖耐量試驗為作為糖尿病診斷的重要標準之一，其試驗結果的準確性，會直接影響到整個實驗的進行，同時由于小型豬在糖耐量試驗中不會像人一樣配合，所以可以采用靜脈糖耐量（ IVGTT） 來代替口服糖耐量（OGTT），但是小型豬在IVGTT試驗中靜脈注射與多次采血都需要抓取固定，會對引起動物應激，從而影響到實驗結果［5］。

Vascular-access-port（簡稱VAP）血管通路可以植入在靜脈中供取血給藥， 并且都能在清醒狀態(tài)下完成。它是一種完全植入的血管通路系統(tǒng)， 植入動物體內后， 可以使動物完全自由， 并且可以減少操作時引起的動物應激， 提高動物福利［6］。對于連續(xù)重復取血和長期植入進行科學研究，VAP血管通路是安全、可靠的， 并且能減少應激反應［7］。本研究設想通過VAP血管通路來改善小型豬IVGTT試驗結果的可靠性， 減少試驗過程中的應激反應， 并且為小型豬IVGTT試驗提供一種便捷快速且穩(wěn)定的新方法。

1　材料與方法

1.1實驗動物

普通級6月齡雄性巴馬小型豬12只，體質量為16～18 kg，由上海市南匯區(qū)老港鎮(zhèn)華新特種養(yǎng)殖場提供［SCXK（滬）2012-0013］，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心普通級實驗室［SYXK（浙）2013-0184］， 環(huán)境溫度為22±1℃， 相對濕度為45%～65%。飼喂全價營養(yǎng)飼料和自由飲水， 12 h/12 h明暗交替， 所有小型豬按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷， 并在適應性恢復8周后開始正式試驗。

1.2主要儀器及試劑

Vascular-access-port，產品編號SLAAC-7S，批號102412S，美國Norfolk醫(yī)藥；速眠新II，吉林省華牧動物保健品有限公司，批號130412；鹿醒寧II，吉林省華牧動物保健品有限公司，批號130407；白云醫(yī)用吻合膠，廣州白云醫(yī)用膠有限公司，批號120902；日立7020全自動生化分析儀；血糖試劑盒，批號25051/952013/1，由德賽診斷系統(tǒng)（上海）有限公司生產；肌酸激酶（CK）試劑盒，批號16452/77752/2，由德賽診斷系統(tǒng)（上海）有限公司生產；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒，批號16318/77745/1、17122/00000154，由德賽診斷系統(tǒng)（上海）有限公司生產； 多功能酶標儀，型號：VARIOSKAN FLASH，生產廠家： Thermo； 豬促腎上腺皮質激素（ACTH）ELISA檢測試劑盒， 批號：E2014052106， 杭州誠維生物科技有限公司生產； 豬皮質醇（CORT）ELISA檢測試劑盒， 批號： E2014052105， 杭州誠維生物科技有限公司生產； 豬胰島素（INS）ELISA檢測試劑盒， 批號： E2014052104，杭州誠維生物科技有限公司生產；碘伏消毒液；青霉素鈉；常規(guī)手術器械。

1.3試驗方法

12只巴馬小型豬隨機分為2組，VAP血管通路植入組（以下簡稱VAP組）與正常對照組（以下簡稱對照組），將VAP組6只巴馬小型豬禁食12 h后，肌肉注射速眠新注射液0.1 mL/kg麻醉后，仰臥位固定，右側大腿內側部位進行剃毛消毒，定位后用刀片切口，分離淺表股靜脈，將分離后的淺表股靜脈遠心端用手術線結扎，近心端用無損血管夾夾閉，然后在血管中間上部橫切，植入7F的VAP血管通路7～10 cm，直至股靜脈總支，縫合和結扎固定血管，并用醫(yī)用吻合膠粘合植入部位。最后在小型豬背部行一2 cm切口，將VAP血管通路導管引導至背部切口位置，并再此處固定血管通路連接頭（簡稱Port）。植入結束后，用生理鹽水沖洗VAP血管通路，并在管內注射100 IU/mL的肝素鈉生理鹽水溶液1～2 mL，注意肝素僅封閉管路不注入體內， 最后縫合各切口部皮膚； 術后完畢， 注射鹿醒寧后放回籠內正常飼養(yǎng)，其間每日注射青霉素溶液80萬 IU，并口服0.2 g阿司匹林鎮(zhèn)痛，連續(xù)5 d

恢復10 d后，隔夜禁食，將VAP組與正常對照組小型豬進行靜脈葡萄糖耐量試驗，將小型豬固定于固定架上，靜置15 min后，取血2 mL（VAP組通過VAP血管通路取血，正常對照組通過頸外靜脈穿刺取血），VAP組通過VAP血管通路注射1.5 mL/kg的50%葡萄糖注射液，正常對照組耳緣靜脈注射1.5 mL/kg的50%葡萄糖注射液，于注射葡萄糖后的5、10、15、30、60、90、120 min分別取血2 mL，并測定血糖（GLU）、CK、LDH INS（日立7600全自動生化分析儀）， ACTH和CORT （Thermo VARIOSKAN FLAS多功能酶標儀）。

1.4統(tǒng)計學處理

2　結果

2.1靜脈注射糖耐量試驗血糖與胰島素結果比較

靜脈注射葡萄糖后，VAP組和對照組小型豬血糖均出現迅速升高，在5 min時，達到最高點而后逐漸下降，至60～90 min時降至注射前水平VAP組小型豬血糖水平在注射前，注射后60 min 90 min以及120 min顯著低于對照組（P＜0.05， P＜0.01），而在注射后5 min血糖水平顯著高于對照組（P＜0.01）（圖1A）； 與此同時，靜脈注射葡萄糖后， VAP組和對照組小型豬胰島素水平也迅速升高，在5～15 min出現高點，并逐漸降低，而VAP組與對照組小型豬胰島素水平，在各時間點并無顯著差異（圖1B）

2.2靜脈注射糖耐量試驗中CK與LDH變化

靜脈注射葡萄糖后，VAP組在各采血點CK與LDH均無明顯變化； 而對照組小型豬在各采血點CK水平均顯著高于VAP組（P＜0.05， P＜0.01）， 且有一定升高趨勢（圖2A）。另外， 對照組小型豬在注射葡萄糖后各采血點LDH水平亦高于VAP組， 但差異不顯著， 且LDH水平有一定升高趨勢（圖2B）。

2.3靜脈注射糖耐量試驗中ACTH與CORT變化

靜脈注射葡萄糖后，VAP組與對照組小型豬ACTH和CORT水平均在5 min時達到最高點，而后逐漸下降，其中VAP組小型豬在60 min既恢復到注射前水平， 對照組小型豬至120 min， 接近注射前水平。對照組小型豬ACTH和CORT在0 min時都高于VAP組，但差異不顯著，而對照組小型豬ACTH和CORT在注射后5 min時都低于VAP組， 且5 min時對照組小型豬ACTH顯著低于VAP組（P＜0.05），對照組小型豬ACTH和CORT在15～120 min時都高于VAP組， 且在60～120 min時差異顯著（P＜0.05， P＜0.01）（圖3A、B）。

3　討論

目前國內外相關安全藥理學指導原則均有明確規(guī)定， 在清醒自由活動狀態(tài)下進行安全藥理學研究。因此， 在研究方法中盡可能采取科學的、可操作性和動物福利保護的實驗技術或替代方法已成為目前研究熱點。VAP血管通路國外早已用于兔、猴、犬以及大鼠上成功植入［8-11］，并進行藥理學毒理學研究， Graham等［12］也對VAP血管通路在Gottingen小型豬上進行應用研究， 并改進了部分實驗方法，VAP血管通路的使用不僅保障動物福利，更將使得在小型豬上進行清醒狀態(tài)下的藥理學和毒理學研究，更加科學準確。

圖1　小型豬在IVGTT試驗中血糖和胰島素變化Figure 1 The changes of blood glucose and insulin in minipigs in IVGTT

圖2　小型豬在IVGTT試驗中CK和LDH變化Figure 2 The changes of CK and LDH in minipigs in IVGTT

葡萄糖耐量試驗為作為糖尿病診斷的重要標準之一， 其試驗結果的準確性， 會直接影響到整個實驗的進行， 而頻繁取樣的IVGTT更加先進和準確， 可動態(tài)觀察血糖與胰島素的相互關系， 判斷胰島素從胰腺的分泌速度以及介導外周組織利用葡萄糖的情況，另外 Chistoffersen等［13］比較了幾種反應小型豬胰島素敏感性的實驗方法，最后指出IVGTT優(yōu)于其它幾種方法，所以小型豬IVGTT試驗在諸多小型豬糖尿病模型的制備中是必不可少的，其準確性也將直接影響實驗的結果。

與VAP組比較，*P＜0.05，**P＜0.01Compared with the VAP group，*P＜0.05，**P＜0.01圖3　小型豬在IVGTT試驗中ACTH與CORT變化Figure 3 The changes of ACTH and CORT in minipigs in IVGTT

有研究認為［5］，應激可以通過影響下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic pituitary adrenal，HPA）軸來調控血糖，主要是由于神經內分泌系統(tǒng)被激活，釋放出來的腎上腺素、去甲腎上腺素、皮質酮等刺激肝、肌糖原迅速分解，造成血糖升高。本實驗結果表明，VAP組與對照組小型豬在IVGTT試驗中血糖變化趨勢相近，均在5 min時出現峰值，并且在60～90 min時降至初始水平，表明兩種方法均在小型豬IVGTT試驗中具有可行性。由于巴馬小型豬較膽小怕人，初次抓取時易發(fā)生掙扎躁動，抓取后需要兩人固定外加一人采血才能完成前腔靜脈穿刺采血工作，而VAP組小型豬采血無需抓取，只需在固定架上一人操作，皮下穿刺入Port即可采血，作者推測可能是對照組小型豬在取血抓取固定過程中的應激較大，激活HPA軸，導致血糖升高，以致對照組小型豬血糖水平在空腹0 min時、以及注射后60～120 min均顯著高于VAP組，但0 min時血糖指標均在可接受正常范圍之內，另外，在IVGTT試驗中ACTH與CORT指標的變化，進一步加強了以上推測的可靠性。不同部位靜脈注射對于藥物效果的差異在臨床上已有共識［14］，血糖指標在5 min時的峰值VAP組要顯著高于對照組，分析原因作者認為可能是使用VAP血管通路進行糖耐量試驗，葡萄糖能通過VAP血管通路迅速大量注入較粗且離心臟較近的下腔靜脈，進入機體回流從而使外周血糖較快升高，而正常對照組通過耳緣靜脈注射葡萄糖，部分血糖會隨著毛血管進入機體，而且相對離心臟回流較遠，使得進入機體時間較慢，導致血糖升高沒有VAP組小型豬強烈作者認為使用VAP血管通路更能真實反應小型豬的靜脈糖耐量試驗反應。另外在IVGTT試驗中，兩組小型豬在各時間點的胰島素含量變化趨勢以及含量均比較相近，無顯著差異，側面說明兩組小型豬在糖耐量試驗中在外源葡萄糖刺激下，胰島素分泌具有較好的一致性。

肌酸激酶（CK）是一種與細胞內能量運轉ATP再生、肌肉收縮等有直接關系的重要激酶， 該酶的含量可以反映肌肉興奮性與肌肉活動情況［15］乳酸脫氫酶（LDH） 是丙酮酸和乳酸可逆反應的氧化還原酶， 是無氧代謝的標志酶［16］。已有研究表明［17］，應激會引起動物血清CK、LDH上升，檢測小型豬糖耐量試驗過程中CK、LDH 的含量，可以了解小型豬在糖耐量試驗過程中機體應激程度的大小本實驗結果顯示，對照組小型豬在糖耐量實驗過程中有應激水平高于VAP組小型豬，VAP組小型豬在糖耐量試驗過程中安靜穩(wěn)定，可以為靜脈糖耐量試驗提供良好試驗環(huán)境。

在應激激活HPA軸以后， 腦垂體前葉分泌ACTH并促使腎上腺皮質在幾分鐘內分泌出CORT［18］， 因此ACTH、CORT常被認為是研究應激的最經典、最重要指標之一。本試驗中兩組小型豬靜脈糖耐量試驗中ACTH、CORT走勢基本和血糖走勢一致，除5 min、10 min外，其余時間點對照組均高于VAP組，且在60 min、90 min與120 min時差異顯著（P＜0.01，P＜0.05），進一步提示之前認為的對照組小型豬在糖耐量試驗取血過程中所受應激較大，從而影響血糖數據的推測。另外試驗中5 min時間點對照組ACTH與CORT低于VAP組小型豬，且ACTH差異顯著（P＜0.05），從另外一方面說明，血液中血糖的迅速升高，對機體來說也是一種應激反應，從而引起ACTH與CORT的快速分泌作為回應，也從側面證明本試驗結果的可靠性。

動物應激對于糖耐量試驗的準確性必然會產生影響，而本試驗通過VAP血管通路對小型豬進行植入，并且在相同條件下與對照組小型豬比較，進行IVGTT試驗后發(fā)現，VAP血管通路組小型豬在糖耐量試驗中動物所受應激更小，更符合動物福利，且試驗結果更加可靠穩(wěn)定。

［1］Bellinger DA， Merricks EP， Nichols TC. Swine models of type 2 diabetes mullitus： insulin resistance glucose and cardiovascular complications［J］. ILAR J， 2006， 47（3）：243-258.

［2］Liu Y， Wang Z， Yin W， et al. Severe insulin resistance and moderate glomerulosclerosis in minipig model induced by highfat/ high-sucrose / high-cholesterol diet［J］. Exp Anim，2007， 56（11）： 11-20.

［3］ McDonald TO， Gerrity RG， Jen C， et al. Diabetes and arterialextracellular matrix changes in a porcine model of atherosclerosis［J］. Histochem Cytochem， 2007， 55（11）：1149-1157.

［4］American Diabetes Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus［J］. Diabetes Care， 2011， 34（suppl 1）：S62-S69.

［5］梁冰， 鄭翔， 夏衛(wèi)維， 等. 慢性束縛應激造模及觀測高血糖相關指標的方法探索［J］. 四川大學學報： 醫(yī)學版， 2013， 44 （3）：470-475.

［6］Taketoh J， Komatsu S， Adachi K， et al. Application of an indwelling vascular access port for intravenous administration in a repeated and intermittent dose toxicity study in rats ［J］. J Toxicol Sci， 2009， 34（1）：39-52.

［7］Senthilkumaran C， Peterson S， Taylor B， et al. Use of a vascular access port for the measurement of pulsatile luteinizing hormone in old broiler breeders ［J］. Poult Sci， 2006， 85（9）：1632-1640.

［8］Perry Clark LM， Meunier LD. Vascular access ports for chronic serial infusion and blood sampling in New Zealand white rabbits［J］. Lab Anim Sci， 1991， 41（5）：495-497.

［9］Wojnicki FH， Bacher JD， Glowa J R. Use of subcutaneous vascular access ports in rhesus monkeys［J］. Lab Anim Sci，1994， 44（5）：491-494.

［10］ Garner D， Laks MM. New implanted chronic catheter device for determining blood pressure and cardiac output in conscious dog［J］. Am J Physiol， 1985， 249（3Pt2）：H681-684.

［11］ Garner D， McGivern R， Jagels G， et al. A new method for direct measurement of systolic and diastolic pressures in conscious rats using Vascular-Access-Ports［J］. Lab Anim Sci， 1988， 38 （2）： 205-207.

［12］ Moroni M， Coolbaugh TV， Mitchell JM， et al. Vascular access port implantation and serial blood sampling in a Gottingen minipig （Sus scrofa domestica） model of acute radiation injury ［J］. J Am Assoc Lab Anim Sci， 2011， 50（1）：65-72.

［13］ Christoffersen B， Ribel U， Raun K， et al. Evaluation of different methods for assessment of insulin sensitivity in Gttingen minipigs： introduction of a new， simpler method ［J］. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol， 2009， 297（4）：R1195-R1201.

［14］ 劉華松， 金曉燕. 不同部位靜脈給藥在靜脈麻醉誘導中的時效差異［J］. 護理研究， 2013 （2）：308-309.

［15］ 吳珊鵬， 羅永湘. 頸總動脈周交感神經網剝脫切除術后痙攣肌肉內酶與肌纖維結構的研究［J］. 中華實驗外科雜志，2001， 18（1）：76-77.

［16］ 李楊， 黃元汛， 冀楠. 運動補劑對機體乳酸脫氫酶和肌酸激酶的影響［J］ . 醫(yī)學理論與實踐， 2009， 22（9）：1062-1064.

［17］ 肖朋， 劉海霞， 王兵. 大鼠心理應激狀態(tài)與咬肌活動性的關系［J］. 新疆醫(yī)科大學學報， 2010， 33（5）：503-506.

［18］ Gaab J， Hü ster D， Peisen R， et al. Hypothalamic-pituitaryadrenal axis reactivity in chronic fatigue syndrome and healthunder psychological， physiological， and pharmacological stimulation［J］. Psychosom Med， 2002， 64（6）：951-962.

Application of Vascular-access-port in Intravenous Glucose Tolerance Test in Minipig

CHEN Liang， PAN Yong-ming， CAI Yue-qin， ZHU Ke-yan， XU Xiao-ping， CHEN Min-li
（Laboratory Animal Research Center/Comparative Medical Research Center，Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China）

ObjectiveTo improve the reliability of intravenous glucose tolerance test （IVGTT） in minipigs and reduce the stress response during the test with vascular-access-port （VAP）， and provides a new method which was fast and convenient and stable for IVGTT in minipigs. MethodsThe 12 Bama minipigs were randomly divided into the implantable VAP group and the normal control group， the difference of the two groups animals in IVGTT were compared， and the stress index were evaluated. ResultsVAP group and the control group could appear glucose tolerance test reactions in IVGTT， changes and the trend in serum insulin levels were not significantly different， but the glucose levels in VAP group at 0 min，60 min， 90 min and 120 min were significantly lower than those of control group （P＜ 0.05， P＜0.01），and significantly higher than that of the control group in 5 min （P＜0.01）； During the test， the CK levels in the control group were significantly higher than the VAP group at each time point （P＜ 0.05，P＜0.01）； ACTH and CORT levels in 0 min ，15-120 min in control group were higher than VAP group，and in 60-120 min had a significant difference （P＜0.05， P＜0.01） ConclusionCompare with conventional methods for IVGTT， VAP implantation way to do IVGTT suffered less stress in minipigs， more in line with animal welfare， and the test results were more reliable and stable.

Vascular-access-port（VAP）； Minipig； Intravenous glucose tolerance test （IVGTT）； Stress

Q95-33

A

1674-5817（2015）02-0114-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.02.006

2014-08-04

浙江省科技廳實驗動物科技計劃項目（2012C37078）

陳亮（1982-）， 男， 實驗師， 研究方向為實驗動物與比較醫(yī)學。E-mail： chl810@foxmail.com

陳民利（1963-）， 女， 教授， 研究方向為實驗動物與比較醫(yī)學。E-mail： minlichen01@yahoo.com