馮　潔，章　蓉，謝建云，李瑞嬌，胡建華，高　誠

（1. 上海實驗動物研究中心，上海市實驗動物質量監(jiān)督檢驗站，上海 201203； 2. 中科院上海生命科學院神經科學研究所，上海 200031； 3. 東華大學化學化工與生物工程學院，上海 201620）

大鼠、小鼠、豚鼠和兔螺桿菌攜帶情況調查

馮潔1，章蓉2，謝建云1，李瑞嬌3，胡建華1，高誠1

（1. 上海實驗動物研究中心，上海市實驗動物質量監(jiān)督檢驗站，上海 201203； 2. 中科院上海生命科學院神經科學研究所，上海 200031； 3. 東華大學化學化工與生物工程學院，上海 201620）

目的了解上海及周邊地區(qū)大鼠、小鼠、豚鼠和兔螺桿菌攜帶情況。方法采集大鼠、小鼠、豚鼠回盲部內容物和兔糞便， 抽提細菌基因組DNA， 采用單重PCR和多重PCR方法進行螺桿菌檢測。結果上述動物螺桿菌陽性率分別為50.5%（105/208）、37.9%（204/538）、36.7%（36/98）和4.9%（12/247）。Helicobacter.hepaticus、H.bilis、H.rodentium三重PCR結果顯示，實驗用兔檢測到H.hepaticus、H.bilis陽性。豚鼠陽性樣本中檢測到H.bilis、H.rodentium陽性。大鼠和小鼠樣本中H.hepaticus、H.bilis、H.rodentium均有陽性檢出。結論上海及周邊地區(qū)大鼠、小鼠、豚鼠和兔均存在不同程度的螺桿菌感染。

螺桿菌； PCR； 嚙齒類； 兔

自從1982年發(fā)現第一株Helicobacter. pylori起，螺桿菌屬這組螺旋彎曲狀的細菌在人類以及實驗動物方面的危害已被大量報道。目前， 研究顯示這類細菌不僅在人或動物的胃炎、消化性潰瘍、胃惡性腫瘤等的發(fā)生中起到相關作用， 也可能與腸道、膽道、肝臟的炎癥性疾病和一些惡性腫瘤的發(fā)生相關［1-5］。從大鼠、小鼠、沙鼠等嚙齒類實驗動物中已陸續(xù)分離到至少13種嚙齒動物螺桿菌， 其中又以Helicobacter. hepaticus、H. bilis、H. rodentium的影響尤為嚴重。因此，在實驗動物生產和使用過程中若隱性感染螺桿菌將會嚴重影響實驗動物質量，延遲實驗進程，對實驗數據的可靠性產生潛在干擾［6，7］。當前全球權威的實驗動物機構或供應商已將其列為實驗動物須排除的病原體，我國實驗動物國家標準尚未將其列入，但近幾年來有多個實驗室報道了從嚙齒類動物體內分離到該菌［8-11］，以及流行病學調查報告。

為詳細了解我國嚙齒類實驗動物螺桿菌攜帶情況，本文采用螺桿菌屬通用的單重PCR方法對上海及周邊地區(qū)嚙齒類實驗動物螺桿菌的攜帶情況進行篩查，主要包括實驗用兔、豚鼠、大鼠、小鼠等。篩查出的陽性樣品再采用H. hepaticus、H. bilis、H. rodentium三重PCR方法作進一步檢測分析，以期補充、完善我國嚙齒類實驗動物螺桿菌流行病學資料，為我國實驗動物的微生物學質量控制提供參考和依據。

1　材料與方法

1.1材料

細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，Taq DNA聚合酶、PCR buffer、Mg2+、 dNTP、100 bp DNA ladder Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司，瓊脂糖購自西班牙Bio-west公司，GoldViewTM核酸染料購自上海賽百盛（SBS）基因技術有限公司。

所有檢測樣品均來自上海、江蘇、浙江地區(qū)不同實驗動物生產和使用單位，級別包括普通級、清潔級和SPF級。

1.2方法

1.2.1樣品制備采集實驗用兔糞便， 豚鼠、大鼠、小鼠回盲內容物， 取0.2 g懸浮于1 mL的PBS（pH7.4），850×g離心5 min， 取上清， 制成細菌懸液。使用細菌基因組DNA抽提試劑盒進行抽提， 操作步驟嚴格按照說明書進行。獲得DNA樣品于-20 ℃保存。1.2.2引物根據GenBank中已發(fā)表的螺桿菌屬16S rRNA及H.hepaticus、H.bills、H.rodentium 16S rRNA序列，參照文獻［12，13］分別設計合成4對特異性引物（表1）。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2.3通用引物PCR檢測 反應體系為20 μL， 其中含PCR緩沖液、dNTP 200 μmol、Taq E 0.15 U、引物各0.5 μmol、模板3 ng， 去離子水補足至20 μL。反應條件： 95℃ 5 min； 95℃ 30 s； 53℃ 30 s和72℃ 30 s 35循環(huán)； 72℃ 10 min。

1.2.4多重PCR檢測采用本單位已建立好的H. hepaticus、H.bills、H.rodentium三重PCR方法［14］對螺桿菌通用引物檢測出的陽性樣品進行檢測。

反應體系為20 μL， 其中Mg2+濃度為2.0 mmol/L，dNTP濃度為200 μmol/L，H. hepaticus、H. bilis H. rodentium引物濃度均為0.625 μmol/L。反應條件同上，退火溫度為52℃。

1.2.5克隆測序隨機抽取陽性PCR產物，經凝膠電泳純化回收后送至生工測序。

表1　螺桿菌屬16SrRNA基因PCR擴增引物

2　結果

2.1通用引物PCR結果

PCR法檢測數據顯示，實驗用兔螺桿菌陽性率為4.9%（12/247）， 其中普通級為5%（12/241）， 清潔級為0（0/6）。豚鼠螺桿菌陽性率為36.7%（36/98），其中普通級為46.2%（36/78），清潔級為0（0/20）。大鼠螺桿菌陽性率為50.5%（105/208），其中清潔級為51.6%（47/91），SPF級為49.6%（58/117）。小鼠螺桿菌感染率為37.9%（204/538），其中清潔級為47.4%（74/156），SPF級為34.0%（130/382）。

2.2多重PCR結果

2.2.1不同種類螺桿菌感染檢測多重PCR檢測結果顯示（表2）， 普通級實驗用兔檢測到H.hepaticus、H.bilis陽性， 未檢測到H.rodentium感染及混合感染樣品； 普通級豚鼠陽性樣本中未檢測到H.hepaticus，H.rodentium陽性率最高， 出現H.bilis和H.rodentium混合感染樣品； 大鼠陽性樣本中， H.hepaticus、H.bilis、H.rodentium均有陽性檢出，能檢測到H.bilis、H.rodentium混合以及3種螺桿菌混合感染； 小鼠陽性樣本中， H.hepaticus、H.bilis、H.rodentium均有陽性檢出，檢測到不同組合的混合感染樣品，即H.hepaticus和H.bilis、H.hepaticus和H.rodentium H.bilis和H.rodentium以及3種螺桿菌混合感染。

2.2.2不同品系大鼠、小鼠螺桿菌感染率本次調查樣本中， 大鼠主要包括SD、Wistar及F344品系各品系螺桿菌陽性率差異不大。小鼠主要包括裸小鼠、KM、ICR、BALB/c、C57BL/6、CBA、DBA C3H/He、FVB、轉基因小鼠等品系，陽性率較高的主要有BALB/c、轉基因小鼠、裸小鼠，ICR等

2.3測序結果

將測序結果與GenBank所發(fā)表的序列進行對比，同源性達99%以上，具體序列見圖1～3。

表2　不同動物螺桿菌分型百分率　　　　　%

圖1　H. hepaticus部分陽性樣品測序后在NCBI中BLAST結果

圖2　H.bilis部分陽性樣品測序后在NCBI中BLAST結果

圖3　H.rodentium 部分陽性樣品測序后在NCBI中BLAST結果

3　討論

近年來， 國內外已有大量報道［15，16］表明大鼠、小鼠種群螺桿菌感染比例呈增長趨勢，雖然螺桿菌感染可能會導致臨床疾病，但由于螺桿菌所產生的病理現象通常呈宿主依賴型， 在臨床上很少被察覺，因此常發(fā)生實驗人員不知道實驗大鼠、小鼠已感染螺桿菌的情況。螺桿菌感染的影響不僅局限于胃腸系統(tǒng)， 也可能對繁殖、肝腸器官及其它器官如乳腺的腫瘤發(fā)展、疫苗免疫應答以及其它方面產生影響。已有大量數據顯示， 用感染螺桿菌的實驗動物進行動物實驗， 將會對實驗數據的可靠性產生一定干擾［17］。因此， 定期檢查實驗動物螺桿菌感染情況并對感染動物進行及時、適當的處理顯得尤為必要。

目前，螺桿菌的實驗室檢測方法主要包括感染早期的細菌學分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化鑒定以及感染后期的免疫學方法（如ELISA）檢測特異抗體，分子生物學方法等。PCR方法作為一種敏感、特異、高效且便于利用的檢測方法，比較適用于螺桿菌的大規(guī)模篩查［18］?；诖?， 本研究首先采用通用引物對實驗用兔糞便，豚鼠、大鼠、小鼠回盲部內容物中螺桿菌16S rRNA基因進行檢測， 判斷其螺桿菌感染情況。再根據已建立的H.hepaticus H.bilis、H.rodentium三重PCR方法對陽性樣品作進一步的種型鑒別。

通用引物檢測結果顯示，實驗用兔螺桿菌感染率均較低。不同級別的豚鼠感染情況差異明顯這可能與飼養(yǎng)環(huán)境有關。大鼠、小鼠螺桿菌感染情況不容樂觀， 且不同級別的差異不明顯。多重PCR檢測結果顯示，在豚鼠和大鼠中， H. rodentium陽性率明顯高于其他兩種，小鼠中H. hepaticus和H. rodentium陽性率略高于H. bilis，混合感染樣本也較多。本次調研所采集的樣品數量有限，后續(xù)應繼續(xù)加大采樣力度，進一步補充調研數據。

此外，不同品系的小鼠感染情況差異較大BALB/c、轉基因小鼠等品系相對較易感，在實際工作中應給予重視。值得注意的是，轉基因小鼠螺桿菌尤其是肝螺桿菌陽性率非常高，推測其原因可能為遺傳基因被人為改造或破壞后導致機體對這類細菌易感，因此在日常飼養(yǎng)管理和科學研究中應充分考慮這一因素帶來的干擾。

已有調查結果［18］表明，當前螺桿菌感染已成為影響實驗動物質量的嚴重隱患之一，從業(yè)人員應嚴肅對待這個問題，同時也提示今后要進一步加大對嚙齒類等實驗動物螺桿菌的科學監(jiān)測與動物日常管理的力度。本文所采用的PCR方法和調研數據可為我國實驗動物螺桿菌的控制提供一定的參考和技術支持。

［1］ Schauer DB. Isolation and characterization of Flexispira rappim： from laboratory mice［J］. J Clin Microbiol， 1994， 31：2709-2714.

［2］王建飛. 嚙齒動物的一種新病原體—螺桿菌（Helicobacter）研究概況［J］. 上海實驗動物科學， 1996， 16（2）：108-110.

［3］Fox JG， Yan L， Shames B， et al. Helicobacter bilis-associated active， chronic hepatitis in aged inbred strains of mice［J］. Contemporary Topics， 1994， 33：66-68.

［4］Fox JG， Dewhirst FE， Tull JG， et a1. Helicobacter hepaticus sp.nov.a microaerophilic bacterium isolated from livers and intestinal mucosal scrapings from mice［J］. J Clin Microbiol，1994， 32：1238-1245.

［5］Zenner L.Pathology， diagnosis and epidemiology of the rodent Helicobacter infection［J］. Comp Immun Microbiol Infect Dis， 1999， 22：41-61.

［6］ Lee A， Phillips MW， O’Rourke JL， et al. Helicobacter muridarum sp.nov， a microaerophilic helicalbacterium with a novel ultrastructure isolated from the intestinal mucosa of rodents［J］. Int J Syst Bacteriol， 1992， 42（1）：27-36.

［7］ Sharp JM， Vanderford DA， Chichlowski M. Helicobacter infection decreases reproductive performance of IL10-deficient mice ［J］. Comp Med， 2008， 58（5）：447-453.

［8］邵偉娟， 謝建云， 陳鴻書， 等. 膽型螺旋桿菌（Helicobacter bilis）的分離、鑒定與序列分析［J］. 微生物學報， 2003， 43 （2）：169-173.

［9］張麗芳， 李紅. 從實驗小鼠成功分離一株嚙齒類螺桿菌——膽汁螺桿菌［J］. 中國實驗動物學報， 2005， 13（2）75.

［10］ 李菁， 林煥建， 姜泊， 等. 我國首株肝螺桿菌的分離培養(yǎng)與鑒定［J］. 南方醫(yī)科大學學報， 2008， 28（5）：843-845.

［11］ 高正琴， 岳秉飛， 賀爭鳴. 首次從中國小鼠中分離到肝螺桿菌及其鑒定［J］. 中國人獸共患病學報， 2009， 25（3）：210-213.

［12］ Goto K， Ohashi H， Takakura A. Current status of Helicobacter contamination of laboratory mice， rats， gerbils， and house musk shrews in Japan［J］. Curr Microbiol， 2000， 4l：161-16 6.

［13］ Lela KR. Craig IF， Reuel RH. Identification of murine Helicobacter by PCR and restriction enzyme analyses ［J］. J Clin Microbiol， 1996， 34：942-946.

［14］ 李瑞嬌， 馮潔， 謝建云， 等. 嚙齒動物螺桿菌多重PCR檢測方法的建立［J］. 中國比較醫(yī)學雜志， 2012， 22（12）：35-40.

［15］ Whary MT， Morgan TJ， Dangler CA， et a1. Chronic active hepatitis induced by Helicobacter hepaticus in the A/JCr mouse is associated with Thl cell-mediated immune response ［J］. Infect Immun， 1998， 66（7）：3142-3148.

［16］ Ward JM， Benveniste RE， Fox CH， et a1. Autoimmunity in chronic active Helicobater hepatitis of mice.Serum antibodies and expression of heat shock protein 70 in liver［J］. Am J Pathol， 1996， 148（2）：509-517.

［17］ Fox JG， Yan LL， Dewhirst FE， et a1. Helicobacter bilis sp. nov.， a novel Helicobacter species isolated from the bile， 1iver，and intestines of aged， inbred mice［J］. J Clin Microbiol，1995， 33：445-454.

［18］ 丁聰， 馮潔， 謝建云， 等. 兩種方法對上海及周邊地區(qū)實驗大小鼠螺桿菌攜帶情況的調查［J］. 中國比較醫(yī)學雜志，2011， 21（12）：66-69.

Q95-33

A

1674-5817（2015）02-0120-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.02.007

2014-07-22

上海市科委基金項目（11140901000、12140900500）

馮潔（1981-）， 女， 副研究員。E-mail： moyifj@163.com