張淑青，袁寶軍，李 超，佟艷艷，王賀永，高利常

（開灤總醫(yī)院 檢驗科，河北 唐山063000）

目前，細菌性血流感染逐年升高，且常引起患者休克、死亡，因此，尋找早期、快速診斷血液細菌感染指標成為研究熱點之一。傳統(tǒng)的白細胞計數(shù)與分類、C－反應(yīng)蛋白等感染指標受機體因素影響較大而缺乏診斷特異性。近年來研究表明，中性粒細胞與淋巴細胞比值（NLR）、中性粒細胞CD64和降鈣素原（PCT）檢測對細菌性感染疾病診斷和治療有較高價值［1－3］。本研究主要通過 ROC曲線探討 NLR、CD64、PCT在診斷血液細菌感染疾病中的價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料 本院收治的疑似血液細菌感染患者254例，其中男性165例，女性89例，分為血培養(yǎng)陽性組（152例），平均年齡為（61.36±11.97）歲，血培養(yǎng)陰性組（102例），平均年齡為（58.57±12.07）歲，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析各組在年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

培養(yǎng)陽性組均為不同部位兩次或多次血培養(yǎng)陽性且為同一種細菌感染者，血培養(yǎng)陰性組為發(fā)熱患者最終排除血液細菌感染者。

1.2 方法

1.2.1 標本采集方法 在患者發(fā)熱及抗生素治療前抽取靜脈血10ml，注入血培養(yǎng)瓶中立刻送檢，同時采集靜脈血2ml于乙二胺四乙酸K2抗凝管進行中性粒細胞與淋巴細胞檢測和CD64測定。另外2ml靜脈血于干燥管，靜置1h，3 000r/min低溫離心10min（離心半徑為17.5cm），提取血清后置－70℃冰箱保存，統(tǒng)一測定PCT。

1.2.2 主要試劑和儀器 所用主要試劑：全自動五分類細胞分析配套試劑購自希森美康生物科技（無錫）有限公司；血培養(yǎng)瓶、微生物鑒定卡片均購自法國梅里埃公司；異硫氰酸熒光素（FITC）標記的抗CD14單克隆抗體、藻紅蛋白（PE）標記的抗CD64單克隆抗體以及同型對照IgG1FITC/IgG2aPE雙色單克隆抗體均購自美國BD Biosciences；PCT檢測試劑購自廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司。所用儀器：日本Sysemex XT－1800全自動五分類細胞分析儀；美國BD公司的FACSCalibur流式細胞儀；法國梅里埃公司Bace/Alert3D全自動血培養(yǎng)儀和VITEK－2Compact微生物鑒定儀；廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司FS－112型免疫熒光檢測儀。

1.2.3 檢測方法 ①血培養(yǎng)方法：放入血培養(yǎng)儀中的培養(yǎng)瓶陽性報警后轉(zhuǎn)種于血平板、中國蘭平板、巧克力平板，并進行涂片鏡檢，病原菌用VITEK－2 Compact鑒定。②PCT測定方法：吸取30μl樣本加入緩沖液中，將樣本與緩沖液充分混勻1min，吸取75μl混勻后的樣本，滴加到測試卡的加樣孔中，室溫下放置15min，將測試卡插入免疫熒光檢測儀中的承載器中進行測試。③CD64測定方法：取2支流式試管，各取100μl抗凝全血，分別加入熒光標記CD14FITC/CD64PE，IgG1FITC/IgG2aPE單克隆抗體各20μl，室溫避光孵育20min，加紅細胞裂解液2ml，渦旋混勻，避光10min，300g/min離心5min，棄上清，用磷酸鹽緩沖液清洗2次，加入含1%多聚甲醛的PBS 0.5ml。置流式細胞儀按常規(guī)進行分析。以前向、側(cè)向光信號及FL1（CD14－FITC）熒光信號分別對淋巴細胞群、單核細胞群及中性粒細胞群進行設(shè)門，相應(yīng)熒光標記的同型對照染色細胞為陰性對照，同時調(diào)節(jié)電壓，閾值，各通道之間的熒光補償，以淋巴細胞作為內(nèi)部陰性對照，單核細胞作為內(nèi)部陽性對照，分析各細胞群CD64平均熒光強度，計算中性粒細胞CD64指數(shù)。每個樣品收集10000個細胞。檢測前使用BD Calibrite三色Beads校準流式細胞儀，嚴格按照說明書操作。用cellquest軟件分析結(jié)果。④NLR檢測：嚴格按照操作規(guī)程進行血液常規(guī)分析，NLR通過中性粒細胞與淋巴細胞數(shù)計算得出。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，偏態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（M）、四分位數(shù)間距（Q）表示，受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析用 MedCalc軟件，其他統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組NLR、CD64和PCT水平變化 血培養(yǎng)陽性組NLR、CD64和PCT水平較培養(yǎng)陰性組明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

2.2 NLR、CD64和PCT在血液細菌感染診斷中的價值 以血培養(yǎng)陽性為金標準，繪制NLR、CD64和PCT的ROC曲線，從圖中可見，PCT曲線下面積（AUC）最大為0.868，CD64和 NLR分別為0.811和0.633。根據(jù) ROC曲線得出 PCT＞0.77ng/mL、CD64＞15.16、NLR＞13.35為最佳截斷值，PCT診斷血液細菌感染的靈敏度為82.4%，特異度為84.9%，Youden系數(shù)為0.54；CD64靈敏度為73.5%，特異度為66.9%，Youden系數(shù)為0.42，NLR靈敏度為68.7%，特異度為71.8%，Youden系數(shù)為0.30，見圖1和表2。

2.3 NLR、CD64、PCT聯(lián)合檢測對血液細菌感染的診斷價值 3指標聯(lián)合檢測的ROC曲線分析結(jié)果顯示，PCT與CD64、CD64與NLR、PCT與NLR聯(lián)合曲線下面積分別為0.914、0.844、0.883；靈敏度分別為86.8%、77.6%、85.0%，特 異 度 分 別 為 89.8%、77.5%、86.5%；三者聯(lián)合檢測 ROC曲線下面積0.924，靈敏度91.2%，特異度90.3%，見圖2和表2。

表1 NLR、CD64、PCT水平變化（以M和Q表示）

圖1 NLR、CD64、PCT的ROC曲線

表2 NLR、CD64、PCT及各指標聯(lián)合檢測的ROC曲線結(jié)果

圖2 NLR、CD64、PCT各個指標聯(lián)合檢測的ROC曲線

3 討論

血液細菌感染是醫(yī)院常見的感染性疾病，其臨床診斷主要依據(jù)疾病的誘因、癥狀、體征、白細胞計數(shù)、血培養(yǎng)等，但血液細菌感染與其他疾病引起的癥狀體征十分相似，尤其是目前送檢血培養(yǎng)的重要體征是發(fā)熱、寒戰(zhàn)等，因此，鑒別患者是細菌性與非細菌性血流感染以及經(jīng)驗治療中抗菌藥物的選擇均是臨床醫(yī)生遇到的難題。傳統(tǒng)的白細胞計數(shù)、C反應(yīng)蛋白檢測等受多種因素影響，血培養(yǎng)時間長、檢出率低等問題均影響疾病的早期診斷與治療。近年來，隨著臨床醫(yī)學(xué)和檢測技術(shù)的發(fā)展，陸續(xù)出現(xiàn)了新的有價值的診斷指標。PCT是一種糖蛋白，是降鈣素的前體，正常情況下通過甲狀腺素細胞分泌，比較穩(wěn)定，而一旦機體受到炎癥刺激，可促使機體肝組織內(nèi)多種細胞分泌，研究表明，在機體受到全身感染3－4 h即可檢測到，并在24h持續(xù)升高，且隨病情加重升高明顯［4］；CD64是中性粒細胞膜上的特殊受體，是能識別免疫球蛋白、介導(dǎo)體液免疫和細胞免疫的Fc受體，正常情況下的外周血中性粒細胞表面呈低水平表達，但在機體受到細菌感染時，CD64表達水平明顯升高，以抵抗機體感染［5］；NLR是中性粒細胞與淋巴細胞比值，它不單表明中性粒細胞在感染中的作用，還與機體淋巴細胞數(shù)量相關(guān)，當機體受到細菌感染時，較白細胞計數(shù)更能真正反映機體的感染狀況，已證實NLR在急性胰腺炎患者中具有較高的預(yù)測價值［6］，PCT和CD64較C反應(yīng)蛋白作為感染性指標價值更高、優(yōu)勢更明顯［7，8］，尤其在感染性休克或嚴重敗血癥中，PCT可用于疾病的診斷［9］。本研究結(jié)果顯示，血培養(yǎng)陽性組PCT、CD64和NLR水平與血培養(yǎng)陰性組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明CD64、PCT和NLR水平在確定血液細菌感染方面均具有一定價值。

ROC曲線是將敏感度和特異度結(jié)合起來綜合評價診斷試驗正確程度的一種方法，根據(jù)ROC曲線下面積在不同范圍對準確程度的判斷，一般認為，ROC曲線下面積在0.7－0.9時具有較高的準確性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NLR、CD64和PCT中，PCT的曲線下面積最大（0.868），靈敏度最高（82.4%），特異度最強（84.9%），說明PCT在早期血液細菌感染診斷中可作為很好的診斷指標，并已證實PCT在細菌性感染中的價值［10］，但也有研究認為，在細菌感染性疾病中，CD64的ROC曲線下面積最大，較PCT更具有價值［8］，其原因可能是對照組病例選擇不同造成，本研究中對照組為臨床發(fā)熱患者而且最終排除血液細菌感染者，除外細菌性血流感染引起發(fā)熱的原因很多，如病毒感染、腫瘤、免疫性疾病、術(shù)后、應(yīng)激反應(yīng)等等，這些因素均可對相應(yīng)指標產(chǎn)生一定影響。

此外，本研究還利用ROC曲線得到3個指標的最佳臨界值，經(jīng)Logistic回歸轉(zhuǎn)化綜合為不同的聯(lián)合指標，作為參數(shù)做ROC曲線計算出不同指標聯(lián)合檢測的曲線下面積和靈敏度、特異度，分析各指標聯(lián)合檢測在血液細菌感染中的價值，以彌補任一單項診斷指標單獨使用時的局限性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，任意2項聯(lián)合檢測較單項檢測曲線下面積、靈敏度和特異度均有所升高，表明聯(lián)合檢測在細菌性疾病診斷中的價值優(yōu)于單項檢測，其中以PCT和CD64聯(lián)合檢測ROC曲線下面積最大（0.914），且具有很好的靈敏度（86.8%）和特異度（89.8%），而以同時聯(lián)合3種指標檢測時具有更好的診斷價值，ROC曲線下面積達到0.914、靈敏度91.2%、特異度90.3%，均較單項或兩兩聯(lián)合檢測有所升高，可能3種指標在早期血液細菌感染時出現(xiàn)的時間不同，在體內(nèi)持續(xù)的時間也有差異，在炎癥過程中出現(xiàn)不同或互補作用所致，這與于建等［11］研究發(fā)現(xiàn)2個或2個以上炎癥指標升高較任何單項指標升高對疾病診斷的準確性高一致。表明PCT和CD64聯(lián)合檢測用于血液細菌感染的診斷價值優(yōu)于單項PCT，而3種指標聯(lián)合檢測更具有較高的診斷價值。

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