何德喜，童 嵐，何汝暢，李曉琴，潘海峰，靳 陽

（1.成武縣人民醫(yī)院，山東 成武274200；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長春130021；3.濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濟寧272000；4.一汽總醫(yī)院，吉林 長春130011；5.濟寧市第一人民醫(yī)院，山東 濟寧272011）

骨肉瘤（Osteosarcoma）也稱成骨肉瘤，是常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤，具有惡性程度高、侵襲性強、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等特點［1］。隨著新輔助化療、手術(shù)、術(shù)后化療的開展，骨肉瘤5年生存率提高到近80%，但仍有半數(shù)以上的患者死于骨肉瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)［2］。有效控制骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移對延長患者生存期有著深遠(yuǎn)意義。

PI3K/AKT細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤的發(fā)生、增殖、遷移、耐藥等生物過程中發(fā)揮著重要作用。AKT是PI3K下游的靶蛋白，是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵蛋白激酶，在多種腫瘤中如卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和口腔鱗癌等腫瘤細(xì)胞中呈過表達［3］。活化的Akt通過影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)而發(fā)揮作用。因此AKT成為研究腫瘤生物學(xué)行為的重要靶點，MK－2206是一種強效的，高特異性及非ATP競爭結(jié)合的Akt變構(gòu)抑制劑［4］，本研究以骨肉瘤細(xì)胞 MG63為實驗材料，檢測MK－2206對骨肉瘤細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響，為骨肉瘤的藥物治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細(xì)胞株MG－63購自上海中科院細(xì)胞庫，生長于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞長至體積比約90%時，進行后續(xù)試驗。

1.1.2 主 要 試 劑 MK－2206 購 自 美 國 Selleck Chemicals公司；RT－PCR 反應(yīng)試劑盒和 DNA Marker購自日本Takara公司；蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；鼠抗β－actin、兔抗p－Akt、兔抗 MMP9、兔抗 TIMP、兔抗 VEGF多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔或小鼠IgG購自北京博奧森公司。

1.1.3 分組 未經(jīng)處理的細(xì)胞為空白對照組、加入等量DMSO的細(xì)胞為溶媒對照組，加入 MK－2206的細(xì)胞為實驗組。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測定細(xì)胞增殖抑制率 取對數(shù)生長期細(xì)胞，制備濃度為4×105/L的細(xì)胞懸液，接種于無菌96孔培養(yǎng)板，每孔200μl，于37℃、5%CO2飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)12h。實驗組分別給予1、2.5、5、10、20μM/L的 MK－2206。每組的每個濃度下設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)24h后，每孔加入20μl的噻唑藍(lán)（MTT 5g/L）。孵育4h后，吸棄各孔培養(yǎng)液，每孔加入DMSO150μl。微振蕩10min后，于酶標(biāo)儀波長490nm處測吸光度（A）值。以上各組實驗重復(fù)6次。細(xì)胞增殖抑制率（%）＝（1－實驗組A值/對照組A值）×100%。

1.2.2 RT－PCR法檢測 mRNA 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞按2×106/孔的細(xì)胞數(shù)接種于6孔板內(nèi)，實驗組給予10μM/L的 MK－2206，培養(yǎng)24h。Trizol裂解各組MG63細(xì)胞提取總RNA，半定量RTPCR法檢測各組細(xì)胞中的CyclinD1、CDk4、VEGF、內(nèi)參照GAPDH，引物見表1。

1.2.3 Western Blot法檢測蛋白表達 將各組細(xì)胞用冷PBS沖洗3次，吸凈PBS液體。在培養(yǎng)瓶中加入400μl蛋白裂解液及4μl苯甲基磺酰氟（PMSF）提取蛋白，喹啉二甲酸二鈉（BCA）法蛋白定量。加入上樣緩沖液，十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠（SDS－PAGE）電泳，每孔蛋白含量約為30 μg。將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜，麗春紅染色，含5% 脫脂奶粉的Tris鹽酸緩沖液（TBST）4℃封閉過夜。在PVDF膜上加入1∶250稀釋的兔抗p－Akt、MMP9、VEGF抗體，1∶500兔抗β－actin雜交2h，PBS洗膜；加入1∶1 000稀釋的羊抗兔二抗，37℃ 孵育2h，增強化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色。觀察各條帶深淺變化并加以分析，β－actin作內(nèi)參照。測量條帶灰度值，與β－actin比值作為蛋白相對表達量。

表1 引物序列表

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析。組間均數(shù)比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MK－2206對骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖的影響

MTT法檢測結(jié)果顯示骨肉瘤細(xì)胞MG63在不同濃度MK－2206作用24h后，細(xì)胞增值率均受到了抑制。1，2.5，5，10，20μM/L濃度時均明顯抑制了骨肉瘤細(xì)胞MG63的增殖，抑制率分別為7.98±4.24%，15.07±3.55%，29.36±3.15%，47.78±3.94%，65.32±3.25%，P＜0.05，并且呈劑量依賴性（見圖1）。10μM/L MK－2206組的增殖抑制率最接近IC50，后續(xù)實驗選用10μM/L濃度。

圖1 MK－2206抑制了骨肉瘤細(xì)胞MG63的增殖

2.2 MK－2206有效阻斷了Akt的磷酸化

10μM/L MK－2206 作 用 MG63 細(xì) 胞 24h，Western－blot法檢測各組細(xì)胞中的p－Akt，實驗組中的p－Akt水平較對照組明顯降低，測得灰度值MK－2206組0.45±0.05，P＜0.01。

圖2 MK－2206阻斷AKT磷酸化

2.3 RT－PCR法檢測增殖相關(guān)基因的表達

RT－PCR結(jié)果顯示 MK－2206可以抑制 MG63細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)基因CD1、CDK4的表達，同時下調(diào)了 VEGF的表達。MK－2206組CyclinD1mRNA 0.87±0.05，P＜0.01；CDk4mRNA 1.04±0.04，P＜0.01和 VEGF mRNA 0.96±0.01，P＜0.01表達量顯著降低。

圖3 MK－2206對骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖相關(guān)基因的影響

2.4 Western Blot法檢測侵襲相關(guān)基因的表達

Western Blot結(jié)果顯示實驗組細(xì)胞中侵襲相關(guān)基因 MMP9表達下降，VEGF表達也下降，MMP9 0.57±0.05，VEGF 0.81±0.06，P＜0.01，說明了MK－2206對骨肉瘤細(xì)胞有抑制侵襲的作用。

圖4 MK－2206抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63侵襲

3 討論

骨肉瘤好發(fā)于青少年，發(fā)病率居原發(fā)骨惡性腫瘤的第1位，在截肢術(shù)作為主要治療方案的年代，其5年生存率不及20%，預(yù)后極差。隨著手術(shù)操作技術(shù)的提高、術(shù)前術(shù)后放化療、新化療藥物的研發(fā)、新輔助化療聯(lián)合保肢治療的發(fā)展，不僅使患者避免了截肢帶來的殘疾，而且將5年生存率提高到80%，明顯延長了骨肉瘤的生存期［5］。腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是骨肉瘤患者死亡的主要原因，有效抑制腫瘤侵襲對防治骨肉瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、改善預(yù)后具有重要意義。

PI3K/AKT細(xì)胞信號轉(zhuǎn)達通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，PI3K通過磷酸化激活A(yù)KT調(diào)控下游基因，誘導(dǎo)系列級聯(lián)反應(yīng)對腫瘤的增殖、凋亡、遷移、侵襲、耐藥等生物過程發(fā)揮重要作用［3］。AKT是PI3K/AKT通路的關(guān)鍵靶點，本實驗采用高選擇性AKT抑制劑MK－2206阻斷AKT磷酸化激活，研究骨肉瘤細(xì)胞GM63增殖及侵襲能力的變化。Western blot結(jié)果表明 MK－2206可以有效阻斷AKT的磷酸化，并且通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)，MK－2206抑制骨肉瘤細(xì)胞 MG63的增殖，隨著MK－2206的濃度升高，抑制作用愈加明顯，具有劑量依賴特點。細(xì)胞周期蛋白CyclinD1是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子之一，CyclinD1表達增高意味著腫瘤細(xì)胞增值能力增強，其可阻斷相應(yīng)的CDks，消除Rb蛋白對細(xì)胞周期的阻滯作用［6］。本實驗通過RT－PCR檢測到MK－2206組細(xì)胞的CyclinD1、CDk4表達降低，說明骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖能力下降。血管內(nèi)皮生長因子VEGF誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)新生血管形成，提供腫瘤細(xì)胞生長需要的營養(yǎng)［7，8］。同時VEGF還具有增強血管內(nèi)皮通透性的作用，促進腫瘤細(xì)胞侵襲。本研究分別檢測骨肉瘤細(xì)胞MG63中VEGF mRNA和蛋白水平的變化，實驗組表現(xiàn)出了VEGF表達的明顯減少，說明MK－2206對骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力起到了抑制作用。Western blot還檢測到實驗組MG63細(xì)胞中金屬基質(zhì)蛋白酶MMP9的下調(diào)表達。MMP9是腫瘤細(xì)胞分解破壞基底膜的主要蛋白酶之一，在腫瘤細(xì)胞的侵襲過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，MMP9的下調(diào)表達說明腫瘤細(xì)胞侵襲能力的降低。

綜上所述，AKT抑制劑 MK－2206通過阻斷AKT磷酸化阻斷了PI3K/AKT細(xì)胞通路對MG63骨肉瘤細(xì)胞的影響，下調(diào)表達了增殖相關(guān)基因CyclinD1、CDk4、VEGF和侵襲相關(guān)基因 MMP9，說明MK－2206可以有效抑制骨肉瘤細(xì)胞 MG63的增殖和侵襲能力，為骨肉瘤的新輔助化療提供了新的理論依據(jù)。

［1］L Mirabello，RJ Troisi，and S A Savage.Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973to 2004：data from the surveillance，epidemiology，and end results program［J］.Cancer，2009，115（7）：1531.

［2］NM Bernthal，N Federman，F(xiàn)R Eilber，et al.Long－term results（＞25years）of a randomized，prospective clinical trial evaluating chemotherapy in patients with high－grade，operable osteosarcoma［J］.Cancer，2012，118（23）：5888.

［3］Liu P，Cheng H，Roberts TM，et al.Targeting the phosphoinositide 3－kinase pathway in cancer［J］.Nat Rev Drug Discov，2009，8：627.

［4］Ae－Ran Choi，Ju－Hwa Kim，and Sungpil Yoon.Sensitization of Cancer Cells through Reduction of Total Akt and Downregulation of Salinomycin－Induced pAkt，pGSk，pTSC2，and p4EBP1by Cotreatment with MK－2206［J］.BioMed Research International，2013，14（9）：17304.

［5］Ottaviani G，Jaffe N.The epidemiology of osteosarcoma［J］.Cancer Treat Res，2009，152：3.

［6］Lukas J，Bartbova J，Rohde M，et al.Cyclin D1is dispensable for G1control in retinoblastoma gene－deficient cells independently of cdk4activity［J］.Mol Cell Biol，1995，15（5）：2600.

［7］Peters KG，De VC，Williams LT.Vascular endothelial growth factor receptor expression during embryogenesis and tissue repair suggests a role in endothelial differentiation and blood vessel growth［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90：8915.

［8］Millauer B，Wizigmann VS，Schnurch H，et al.High affinity VEGF banding and developmental expression suggest flk－las a major regulator of vasculogenesis and angiogenesis［J］.Cell，1993，72：835.