鄔真力 王玲 趙興勝 孟軍軍 蘇鄭剛 姜巧珍 陳華 安勁松

基礎(chǔ)研究

依普利酮抑制急性心肌梗死大鼠心肌纖維化的作用機(jī)制

鄔真力 王玲 趙興勝 孟軍軍 蘇鄭剛 姜巧珍 陳華 安勁松

目的觀察依普利酮對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）及心肌纖維化的影響。方法 結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈制作急性心肌梗死大鼠模型。隨機(jī)分為急性心肌梗死組（10例）和依普利酮治療組（12例）；另設(shè)假手術(shù)組（12例），為僅打開(kāi)心包腔未行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎大鼠。分別用依普利酮30 mg·kg-1·d-1和等量生理鹽水灌胃4周。心肌Masson染色法測(cè)定心肌膠原密度，測(cè)算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）和血管周圍膠原面積（PVCA）；堿水解法測(cè)定羥脯氨酸（Hyp）含量；放射免疫法檢測(cè)心肌醛固酮（ALD）含量；Westernblot檢測(cè)心肌TGF-β1表達(dá)。結(jié)果 急性心梗組大鼠心肌組織中CVF、PVCA、Hyp較假手術(shù)組顯著增加（P＜0.01），心肌 ALD、TGF-β1表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；依普利酮治療組大鼠心肌中 CVF、PVCA、Hyp較急性心梗組顯著降低（P＜0.01），心肌TGF-β1表達(dá)顯著減低（P＜0.05）。結(jié)論 抑制急性心肌梗死大鼠心肌組織中TGF-β1表達(dá)，可能是依普利酮抑制心肌纖維化的機(jī)制之一。

急性心肌梗死； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1； 心肌組織； 依普利酮

急性心肌梗死（AMI）時(shí)，由于大量心肌組織壞死，人體內(nèi)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）過(guò)度激活，作為RAAS下游產(chǎn)物，醛固酮（ALD）可觸發(fā)心肌間質(zhì)中膠原堆積，引起心肌纖維化，導(dǎo)致心室重塑、心功能衰竭[1-4]。目前研究認(rèn)為，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）是ALD觸發(fā)心肌纖維化的重要靶點(diǎn)，在AMI后心肌纖維化過(guò)程中起到重要的作用[5]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，選擇性醛固酮受體拮抗劑——依普利酮可以抑制心肌膠原過(guò)度沉積，從而減輕心肌纖維化[6]。本實(shí)驗(yàn)用依普利酮對(duì)AMI大鼠進(jìn)行干預(yù)治療，通過(guò)觀察心肌組織TGF-β1及膠原含量的變化，探討依普利酮減輕心肌纖維化可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 小動(dòng)物人工呼吸機(jī)，第二軍醫(yī)大學(xué)DW-2000型；依普利酮購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；ALD放射免疫試劑盒購(gòu)于中國(guó)原子能科學(xué)研究院；羥脯氨酸試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠TGF-β1單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（羊抗兔IgG）購(gòu)自武漢博士德公司；天狼猩紅染料購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制作和分組 雄性SD大鼠180～220 g（由內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物所提供），采用左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎制作AMI大鼠模型。戊巴比妥鈉（35 mg/kg）腹腔麻醉，行氣管插管，接小動(dòng)物呼吸機(jī)，沿左胸骨第4～5肋間開(kāi)胸，暴露心臟并打開(kāi)心包腔，在左心耳和右心室流出道之間以6.0無(wú)創(chuàng)絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，肉眼觀察前降支供血區(qū)變蒼白，心電圖導(dǎo)聯(lián)ST段弓背向上抬高，提示AMI手術(shù)成功，擠壓胸腔以排出空氣并逐層關(guān)閉胸腔。術(shù)后經(jīng)腹腔注射慶大霉素2.4×104U·kg-1·d-1，共3 d，預(yù)防感染。將造模手術(shù)存活SD大鼠隨機(jī)分為急性心梗組（n=10）和依普利酮治療組（n=12）；另設(shè)假手術(shù)組（n=12），為僅打開(kāi)心包腔而未行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎大鼠。各組大鼠經(jīng)苦味酸標(biāo)記后行藥物灌胃，治療組給予依普利酮30 mg·kg-1·d-1灌胃，急性心梗組和假手術(shù)組給予等量去離子水灌胃。

1.2.2 組織標(biāo)本的采集和保存 大鼠持續(xù)灌胃4周后，稱體重（BW），之后處死大鼠，迅速開(kāi)胸摘取心臟，用預(yù)冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干后沿房室環(huán)剪去心房、大血管、心外脂肪組織及右心室，稱量左心室重量（LVW），計(jì)算左心室重量指數(shù)（LVI）=LVW/BW。在左室長(zhǎng)軸中點(diǎn)垂直于長(zhǎng)軸處，切取厚度為2 mm的左心室截面，行病理組織學(xué)檢查。其余心肌組織去大血管及脂肪后用錫紙包存，立即液氮速凍后-80℃保存，用于心肌組織ALD、TGF-β1等檢測(cè)。

1.2.3 氯化三苯基四氮唑染色及梗死面積測(cè)定將左心室截面心肌切成2 mm厚切片，置1%TTC磷酸鹽緩沖液中，放入37℃恒溫水浴箱20 min之后在10%甲醛中固定。正常心肌染色呈磚紅色，壞死心肌呈灰白色。在放大10倍下獲取左心室截面的切片圖像，用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分別測(cè)量心肌瘢痕弧長(zhǎng)及左心室心內(nèi)、外膜周長(zhǎng)，根據(jù)公式計(jì)算梗死面積（IS）。IS=［（瘢痕外周弧長(zhǎng)+瘢痕內(nèi)周長(zhǎng)）/（左心室心外膜周長(zhǎng)+左心室心內(nèi)膜周長(zhǎng)）]×100%。計(jì)算心肌梗死面積百分比。

1.2.4 心肌Masson染色法測(cè)定膠原容積分?jǐn)?shù) 在左心室長(zhǎng)軸中點(diǎn)處，切取厚度為2 mm的左心室截面，于4%多聚甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋，連續(xù)5 μm切片，行心肌Masson染色后，在500倍視野下，使用ImageProplus病理圖像分析系統(tǒng)，測(cè)量選定區(qū)域染色組織的面積，計(jì)算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）及血管周圍膠原面積（PVCA），取平均值。

1.2.5 心肌羥脯氨酸含量測(cè)定 稱取心肌組織100 mg，生理鹽水洗凈后，剪碎，加水解液1 ml混勻，放入帶蓋的玻璃磨口試管中，沸水浴水解20 min，按照說(shuō)明書(shū)依次加入試劑，調(diào)pH值至6.0～6.8，以3500 r/min離心10 min，取上清液1 ml檢測(cè)。經(jīng)氯氨T氧化，對(duì)二甲氨基苯甲醛顯色，利用分光光度計(jì)測(cè)各個(gè)標(biāo)本吸光度，計(jì)算心肌組織中羥脯氨酸（Hyp）含量。

1.2.6 放射性免疫方法測(cè)定心肌組織ALD含量取左心室心肌組織20 mg，剪碎后加入0.5 mol/L乙酸，煮沸15 min，冷卻后勻漿，以12 000 r/min離心15 min，取上清液檢測(cè)組織ALD含量。按ALD放免試劑盒說(shuō)明操作測(cè)定心肌組織的ALD含量。

1.2.7 Western-blot檢測(cè)大鼠心肌TGF-β1蛋白表達(dá) 取心肌組織100 mg，剪碎后加入1.5 ml含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，10 mmol/L EDTA，pH 7.2，1%去氧膽酸鈉，0.6 mmol/L PMSF，4 μmol/L 亮抑制肽，100 kU/L抑肽酶，100 μmol/L原釩酸鈉），冰盒內(nèi)操作勻漿器，冰上裂解心肌組織10 min后，10 000 r/min低溫離心15 min，取上清裝入EP管中，總蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。取蛋白質(zhì)樣品每份50 μg，加等量樣本處理液，100℃煮沸4 min；7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBS-T封閉2 h；加入兔抗鼠TGF-β1單克隆抗體（1∶200）孵育，4 ℃過(guò)夜，TBS洗膜液洗滌5 min，共3次；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔 IgG（1∶5 000）孵育 1 h，洗膜液洗滌 5 min，共3次；然后暗室顯影并壓片曝光；結(jié)果用圖像分析系統(tǒng)測(cè)定蛋白質(zhì)條帶相對(duì)吸光度（A）值/β肌動(dòng)蛋白（β-actin）比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 12.0軟件包行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠左室重量指數(shù)、梗死范圍比較 急性心梗組大鼠LVI較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.01），依普利酮組LVI較急性心梗組減低，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表 1。

表1 各組大鼠左室重量指數(shù)、梗死范圍比較（±s）

表1 各組大鼠左室重量指數(shù)、梗死范圍比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與急性心梗組比較，bP＜0.05

梗死范圍（%）假手術(shù)組 12 394.8±37.2 2.3±0.8 -急性心梗組 10 425.9±33.7 4.1±0.9a 39.5±7.3依普利酮組 12 404.2±38.0 3.3±0.8ab 37.6±5.8組別 例數(shù) 體重（g）左室重量指數(shù)（mg/g）

2.2 各組心肌纖維化的變化 Masson染色法可清晰顯示心肌膠原呈藍(lán)色，分布于心肌內(nèi)，向細(xì)胞間質(zhì)呈放射狀分布。假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞之間、血管周圍有少量膠原纖維；急性心梗組大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維明顯增多，排列紊亂，毛細(xì)血管周圍膠原增多；依普利酮組大鼠心肌膠原增生現(xiàn)象減少，心肌膠原積聚明顯減輕（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。根據(jù)各組所含Hyp、CVF、PVCA判斷心肌纖維化程度，與假手術(shù)組比較，急性心梗組大鼠存在著明顯的心肌纖維化（P＜0.01），而依普利酮組心肌纖維化程度較急性心梗組明顯減輕，心肌纖維化范圍明顯縮?。≒＜0.01）。見(jiàn)表 2。

表2 三組大鼠心肌纖維化相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

表2 三組大鼠心肌纖維化相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與急性心梗組比較，bP＜0.01，cP＜0.05

組別 例數(shù) 心肌羥脯氨酸（μg/g） 心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（%） 血管周圍膠原面積（%） 心肌ALD（pg/mg） 心肌TGF-β1假手術(shù)組 12 345.0±43.1 3.24±0.23 1.26±0.17 8.3±2.2 0.8±0.2急性心梗組 10 521.6±56.9a 6.48±0.35a 2.53±0.23a 18.7±4.1a 1.6±0.4a依普利酮組 12 451.5±43.4ab 5.26±0.29ab 1.89±0.13ab 15.9±3.7a 1.2±0.4ac

圖1 三組心肌Masson′s染色結(jié)果比較（×500）

2.3 各組心肌組織中ALD、TGF-β1變化 如表2所示，急性心梗組大鼠心肌組織中ALD、TGF-β1含量均較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.01）；經(jīng)過(guò)依普利酮干預(yù)4周后，心肌組織中TGF-β1含量較急性心梗組顯著降低（P＜0.05）。

3 討論

大量研究表明，AMI后腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RASS）過(guò)度激活，作為RASS的下游產(chǎn)物，ALD不僅由腎臟合成、分泌，AMI后心肌組織通過(guò)自分泌和旁分泌，使心肌局部合成的ALD顯著增加，ALD促使非梗死區(qū)心肌細(xì)胞肥大、成纖維細(xì)胞過(guò)度增生、心肌間質(zhì)中膠原纖維異常積聚，最終導(dǎo)致心肌發(fā)生纖維化改變。因此，AMI后心肌纖維化的發(fā)生與ALD過(guò)度表達(dá)密切相關(guān)，這也是ALD重要的非血流動(dòng)力學(xué)致病作用[1]。ALD可以通過(guò)鹽皮質(zhì)激素受體通路，上調(diào)心肌成纖維細(xì)胞TGF-β1表達(dá)，并刺激TGF-β1由無(wú)活性狀態(tài)轉(zhuǎn)化為活性狀態(tài)，引起細(xì)胞外基質(zhì)代謝失調(diào)，進(jìn)而參與心肌纖維化過(guò)程[7,8]。由此可見(jiàn)，TGF-β1是ALD介導(dǎo)心肌纖維化的重要靶點(diǎn)。

TGF-β1屬于TGF-β家族中的一個(gè)成員，它是具有多種功能的蛋白多肽，由單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞等分泌，與靶細(xì)胞上相應(yīng)受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[9]，參與通過(guò)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)的生成，參與組織炎癥修復(fù)過(guò)程。有研究表明，細(xì)胞外膠原蛋白的大量合成是心肌纖維化發(fā)生的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)，TGF-β1通過(guò)刺激細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)錄、合成膠原蛋白，促進(jìn)膠原蛋白沉積于細(xì)胞間質(zhì)，并抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的表達(dá)，使細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，降解減少，細(xì)胞外基質(zhì)堆積，引起心肌纖維化進(jìn)一步發(fā)展，導(dǎo)致心肌僵硬度增加，順應(yīng)性降低[10,11]。因此，TGF-β1作為重要的促纖維化生長(zhǎng)因子，通過(guò)對(duì)心肌細(xì)胞外基質(zhì)的生成及降解的調(diào)控，在心肌纖維化的病理過(guò)程中起關(guān)鍵作用。

Hyp是膠原蛋白特有的氨基酸，其含量可反映細(xì)胞外基質(zhì)總體水平，進(jìn)而反映心肌纖維化程度。本研究發(fā)現(xiàn)，AMI組大鼠心肌組織中ALD、TGF-β1含量均較假手術(shù)組顯著增高，同時(shí)以Hyp作為心肌纖維化程度的指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)AMI組大鼠心肌Hyp、CVF、PVCA 顯著高于假手術(shù)組（P＜0.01），提示 AMI時(shí)存在著心肌局部ALD的過(guò)度表達(dá)，而激活的ALD可能通過(guò)TGF-β1引起心肌纖維化。

依普利酮是具有高度選擇性的醛固酮受體拮抗劑，與鹽皮質(zhì)激素受體結(jié)合，通過(guò)抑制醛固酮受體復(fù)合物的形成，阻斷心肌組織激活的ALD，從而抑制心肌纖維化[12]。EPHESUS試驗(yàn)[13]是一項(xiàng)大規(guī)模前瞻性、多中心、隨機(jī)、雙盲臨床研究，該試驗(yàn)入選AMI患者為研究對(duì)象，評(píng)估依普利酮對(duì)AMI患者的有效性及生存率的影響。結(jié)果證明，依普利酮可以有效降低AMI后心衰的發(fā)病率和病死率，患者心血管全因死亡率和再次住院率明顯降低。其亞組分析顯示，依普利酮可以通過(guò)阻斷AMI后心肌膠原蛋白的形成，減少心肌細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，進(jìn)而減輕AMI后心肌纖維化，這可能是依普利酮改善AMI患者預(yù)后的重要因素。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，依普利酮可減輕AMI后大鼠心肌膠原蛋白的合成，減輕心肌纖維化，抑制心室重構(gòu)，從而改善射血分?jǐn)?shù)，增加心輸出量，而這些作用與依普利酮的降壓效應(yīng)無(wú)關(guān)[14]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在AMI后大鼠的未梗死區(qū)心肌中，出現(xiàn)大量膠原沉積，經(jīng)過(guò)依普利酮干預(yù)治療后，非梗死區(qū)心肌纖維化得到明顯抑制，而梗死區(qū)心肌組織的修復(fù)未受到影響[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用依普利酮治療4周后，依普利酮可以下調(diào)AMI大鼠心肌組織中TGF-β1的表達(dá)。隨著TGF-β1表達(dá)下調(diào)，Hyp、CVF、PVCA 顯著降低，提示依普利酮可能通過(guò)改變心肌組織TGF-β1水平，影響心臟纖維化的進(jìn)程。

總之，心肌纖維化是AMI后心室重塑的重要環(huán)節(jié)。ALD作為RASS下游產(chǎn)物，通過(guò)上調(diào)TGF-β1表達(dá)導(dǎo)致心肌纖維化。依普利酮可以有效降低心肌組織中TGF-β1表達(dá)，這可能是依普利酮減輕AMI后心肌纖維化的重要機(jī)制之一。

［1]Atlas SA.The renin-angiotensin aldosterone system：pathophysiological role and pharmacologic inhibition.J Manag Care Pharm，2007，13：9-20.

［2]van den Borne SW，Diez J，Blankesteijn WM.Myocardial remodeling after infarction：the role of myofibroblasts.Nat Rev Cardiol，2010，7：30-37.

［3]劉曉玲，胡桃紅.急性心肌梗死后左室重構(gòu)的診斷及干預(yù).中國(guó)心血管病研究，2009，7：238-240.

［4]劉穎，蘇晞，鄧成鋼，等.急性心肌梗死并心源性休克的院內(nèi)死亡危險(xiǎn)因素分析.中國(guó)心血管病研究，2014，12：231-234.

［5]Gaddam KK，Pimenta E，Husain S，et al.Aldosterone and cardiovascular disease.Curr Probl Cardiol，2009，34：51-84.

［6]Shafiq MM，Miller AB.Blocking aldosterone in heart failure.Ther Adv Cardiovasc Dis，2009，3：379-385.

［7]Lee YS，Kim JA，Kim KL，et al.Aldosterone upregulates connective tissue growth factor gene expression via p38 MAPK pathway and mineralocorticoid receptor in ventricular myocytes.J Korean Med Sci，2004，19：805-811.

［8]鄔真力，王雙雙，許頂立，等.雷米普利對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌鹽皮質(zhì)激素受體的影響.中華老年心腦血管病雜志，2009，11：288-291.

［9]Mauviel A.Transforming growth factor-beta：a key mediator of fibrosis.Methods Mol Med，2005，117：69-80.

［10]Bujak M，F(xiàn)rangogiannis NG.The role of TGF-beta signaling in myocardial infarction and cardiac remodeling.Cardiovasc Res，2007，74：184-195.

［11]Dobaczewski M，Chen W，F(xiàn)rangogiannis NG.Transforming growth factor（TGF）-beta signaling in cardiac remodeling.J Mol Cell Cardiol，2011，51：600-606.

［12]Kobayashi N，Yoshida K，Nakano S，et al.Cardioprotective mechanisms of eplerenone on cardiac performance and remodeling in failing rat hearts.Hypertension，2006，47：671-679.

［13]Pitt B，Remme W，Zannad F，et al.Eplerenone，a selective aldosterone blocker，in patients with left vent ricular dysfunction after myocardial infarction.N Engl J Med，2003，348:1309-1321.

［14]Wang D，Liu YH，Yang XP，et al.Role of a selective aldosterone blocker in mice with chronic heart failure.J Card Fail，2004，10：67-73.

［15]Delyani JA，Robinson EL，Rudolph AE，et al.Effect of a selective aldosterone receptor antagonist in myocardial infarction.Am J Physiol heart Circ pohysiol，2001，281：647-654.

Mechanisms of inhibited myocardial fibrosis by Eplerenone following acute myocardial infarction in rats

WU Zhen-li，WANG Ling，ZHAO Xing-sheng，et al.Department of Cardiology，Inner Mongolia Hospital，Hohhot 010017，China

ObjectiveTo investigate the effect of Eplerenone on cardiac transforming growth factor-β1（TGF-β1）in rats after acute myocardial infarction （AMI）.MethodsThe rat model of AMI was established by ligating the left coronary artery in male SD rats.The survived rats were randomly divided to AMI group （n=10），Eplerenone group （30 mg·kg-1·d-1）（n=12） and sham-operated group （n=12）.After four weeks，the collagen volume fraction（CVF）and perivascular collagen area（PVCA）of cardiac tissues were calculated by Masson′s Trichrome.Alkaline hydrolysis method was used to detect the concentration of hydroxyproline （Hyp） in the myocardium of left ventricle.The contents of aldosterone（ALD） were determined by radioimmunoassay.The expressions of TGF-β1were determined by Western-blot.ResultsThe CVF，PVCA and Hyp in cardiac tissues were significantly increased than that in sham-operated group （P＜0.01）.The expression of TGF-β1and Ald in cardiac tissues were also increased dramatically in AMI group compared with sham-operated group（P＜0.01）.After four weeek′s treatment with Eplerenone，the expression of TGF-β1in the cardiac tissues have continuous decrease in comparision with AMI group （P＜0.05）.At the same time，CVF，PVCA and Hyp in cardiac tissues were considerablely depressed than that in AMI group（P＜0.01）.ConclusionEplerenone can reduce reactive cardiac fibrosis following AMI，which partly contributes to attenuating cardiac TGF-β1.

Acute myocardial infarction； Transforming growth factor-β1； Cardiactissues；Eplerenone

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2011BS1109）

010017 內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市，內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科

10．3969/j．issn．1672－5301．2015．02．022

Q95-33；R542.2+2

A

1672-5301（2015）02-0177－04

2014-12-21）