方志榮，蔡光澤

(西昌學(xué)院，四川 西昌615013)

珙桐未成熟胚的萌發(fā)及植株再生的研究*

方志榮，蔡光澤

(西昌學(xué)院，四川 西昌615013)

為了建立珙桐的再生體系，試驗(yàn)以珙桐未成熟胚為外植體，獲得了再生植株。采用正交設(shè)計(jì)和極差分析法對(duì)影響未成熟胚再生植株的四種主要因素α-萘乙酸（α-Naphthaleneacetic acid,NAA）、噻苯隆(Thidiazuron,TDZ)、赤霉素(gibberellic acid,GA)和活性炭(active carbon,AC)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：胚萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基組合為WPM+0．09 mg/L NAA +0．6 mg/L TDZ+0．9 mg/L GA+0．8 g/L AC，芽誘導(dǎo)率為71．43%；萌發(fā)胚芽分化及生根的最佳培養(yǎng)基組合為WPM培養(yǎng)基+ 0．1 mg/L NAA+3 mg/L TDZ+6 mg/L GA+1．2 g/L AC，再生率為50%。AC能促進(jìn)下胚軸變綠和子葉變綠，NAA、GA對(duì)解除胚的形態(tài)后熟有重要作用。GA和TDZ在芽分化及生根過程中起主導(dǎo)作用。

珙桐；未成熟胚；再生植株

珙桐(Davadia involucrataBaill)又名鴿子樹，為我國特有的珙桐科(Davadiaceae)單型屬植物。系第三紀(jì)古熱帶植物區(qū)系的孑遺種，有“活化石”之稱，是世界著名的觀賞植物，被列為國家一級(jí)珍稀瀕危保護(hù)植物[1]。珙桐天然分布在我國的貴州、湖南、湖北、陜西、四川、云南以及甘肅7省，7省內(nèi)分布范圍較窄，資源量較少，僅限于一些邊遠(yuǎn)山區(qū)人跡罕到之處[2]。

在自然狀態(tài)下，珙桐種子休眠期長(zhǎng)，萌發(fā)率低，存在二次休眠，其中種胚的形態(tài)后熟和生理后熟是種子休眠的主要原因[3,4]。新采收的珙桐種子必須在濕砂中層積近2年才能逐漸分化成具有纖毛和葉脈的胚芽，完成形態(tài)后熟。此后大部分種子進(jìn)入二次休眠，須繼續(xù)層積2年，才能迅速萌發(fā)[3]。利用成熟期果實(shí)中的未成熟胚為外植體，采用加入外源激素的辦法可以縮短未成熟胚完成形態(tài)后熟的時(shí)間，實(shí)現(xiàn)未成熟胚萌發(fā)[5,6]。然而，迄今為止尚無利用珙桐成熟前期果實(shí)中的未成熟胚直接再生植株并無報(bào)道。

本研究以珙桐成熟前期果實(shí)中的未成熟胚為材料，研究了以珙桐未成熟胚為外植體直接再生植株的培養(yǎng)基配方，以期為研究珙桐未成熟胚的后熟提供材料，為珙桐未成熟胚再生體系激素配方的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2012年9月1日于四川省雅安市滎經(jīng)縣龍蒼溝(海拔:1530 m,N 29.33°,E 102.44°)采集珙桐當(dāng)年生果實(shí)，帶回實(shí)驗(yàn)室后4℃保存。

表1 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平

1.2 研究方法

1.2.1 培養(yǎng)基的篩選

本實(shí)驗(yàn)共分為兩個(gè)階段，第一階段先誘導(dǎo)未成熟胚萌發(fā)；第二階段誘導(dǎo)芽分化及生根。以WPM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用正交設(shè)計(jì)法對(duì)影響珙桐胚培養(yǎng)的四種主要因素α-萘乙酸（ α-Naphthaleneaceticacid,NAA）、噻 苯 隆(Thidiazuron,TDZ)、赤霉素(gibberellic acid,GA)和活性炭(active carbon,AC)進(jìn)行研究，試驗(yàn)因素及水平設(shè)置見表1。試驗(yàn)方案及結(jié)果分析見表2，表3。

1.2.2 接種及培養(yǎng)試驗(yàn)

剝?nèi)ョ钔┕麑?shí)的外果皮和中果皮后，用小鐵錘小心敲開內(nèi)果皮，從果核深溝里再小心挑出種子，剝?nèi)ヅ呷椋瑢⑽闯墒炫咧糜诩兯薪?0分鐘。在超凈工作臺(tái)上，先用75%乙醇滅菌20秒，無菌水沖洗3～4次，再用0.1%的升汞滅菌40秒，無菌水沖洗5次以上。將上述滅菌后的未成熟胚接種于含不同濃度激素的胚萌發(fā)培養(yǎng)基上。每瓶接2個(gè)胚，每組8瓶。將培養(yǎng)物放入人工氣候箱中光照16 h，黑暗8 h，溫度25℃培養(yǎng)。以上胚軸開始出現(xiàn)肉眼可見的芽為萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)，30天后統(tǒng)計(jì)胚的萌發(fā)率。萌發(fā)率=(未污染萌發(fā)胚數(shù)/未污染總胚數(shù)）x100%。將未污染的萌發(fā)的胚轉(zhuǎn)接到芽分化及生根培養(yǎng)基上。每瓶接1個(gè)胚，每組12瓶。

2 結(jié)果與分析

2.1 未成熟胚芽誘導(dǎo)、芽分化及生根

圖1 珙桐未成熟胚的萌發(fā)及植株再生

有關(guān)珙桐休眠的原因主要有3種：（1）內(nèi)果皮（圖1①）堅(jiān)硬，透水性和透氣性差，及機(jī)械阻力造成珙桐種子休眠[4]。（2）未成熟胚的形態(tài)后熟和生理后熟是造成種子休眠的另一重要原因[3]。余阿梅等采用在濕沙中沉積1年的未成熟胚為材料，以1/2 MS+ 0.5 mg/L IBA+1 mg/L BA+2.85 mg/L GA+0.25 mg/L AC為培養(yǎng)基誘導(dǎo)未成熟胚萌發(fā)，實(shí)驗(yàn)中以幼根超過該胚的長(zhǎng)度為萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)，30天優(yōu)化后的培養(yǎng)基萌發(fā)率為87.72%[5]。董社琴等以新采收珙桐果實(shí)的種胚為材料，未成熟胚4℃處理21天后進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)后的56天發(fā)現(xiàn)MS+4.0 mg/L BA+12 mg/L GA+3 mg/L IAA培養(yǎng)基上的未成熟胚萌發(fā)[6]。本研究中，接種在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的白色胚（圖1②）10天以后下胚軸及子葉變成綠色（圖1③），30天后在上胚軸開始出現(xiàn)肉眼可見的芽（3 mm以上）（圖1④），未成熟胚萌發(fā)的時(shí)間與前人報(bào)道相比有所縮短，此時(shí)的胚已經(jīng)完成形態(tài)后熟。（2）珙桐果實(shí)中含有大量的抑制種子萌發(fā)的物質(zhì)是造成珙桐種子休眠的又一重要的原因。除果肉，內(nèi)果皮和胚乳外，胚自身也含有抑制萌發(fā)的物質(zhì)[7]。對(duì)珙桐生殖物候的研究表明，珙桐5月下旬形成幼果，10月中下旬果實(shí)成熟，并開始脫落[8]。本研究取材的時(shí)間處于果實(shí)的生長(zhǎng)期，此時(shí)未成熟胚中含有的萌發(fā)抑制物質(zhì)低于成熟期的萌發(fā)抑制物質(zhì)，可能是未成熟胚發(fā)芽時(shí)間縮短的原因。完成形態(tài)后熟的胚在芽分化及生根培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，則50天可以分化出芽（圖1⑤）及70天后產(chǎn)生再生植株（圖1⑥）。

表2 未成熟胚芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基正交設(shè)計(jì)方案、結(jié)果及極差分析

2.2 不同因素組合對(duì)未成熟胚芽誘導(dǎo)的影響

未成熟胚芽誘導(dǎo)可以分為下胚軸變綠、子葉變綠和萌發(fā)三個(gè)階段（表1）。極差分析的結(jié)果表明，在三個(gè)階段中，活性炭（AC）發(fā)揮了重要作用。這一結(jié)果與余阿梅試驗(yàn)結(jié)果一致，一定量的活性炭能吸附胚中的萌發(fā)抑制物質(zhì)[5]，然而過多的活性炭可能吸附培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物NAA、TDZ、GA使未成熟胚芽誘導(dǎo)率下降。董社琴等報(bào)道了IAA對(duì)解除種子形態(tài)后熟有作用，GA對(duì)解除生理后熟至關(guān)重要[6]。從表1的分析可以得出：NAA在芽誘導(dǎo)的前期發(fā)揮了重要作用，到后期GA顯示出重要的作用。綜合表1的結(jié)果，可以得到優(yōu)化后的培養(yǎng)基為WPM+0.09 mg/L NAA+0.3 mg/L TDZ+0.9 mg/L GA+0.8 g/L AC。

2.3 不同因素組合對(duì)萌發(fā)胚芽分化及生根的影響

陳坤榮等用GA和6-BA浸泡二次休眠的珙桐種子1周，可使珙桐種子在半個(gè)月內(nèi)萌發(fā)出苗，說明珙桐種子完成形態(tài)后熟后，外源激素GA和6-BA對(duì)解除種子休眠至關(guān)重要[3]。雷濘菲等測(cè)定了珙桐種子休眠萌發(fā)過程中，內(nèi)源激素的變化，發(fā)現(xiàn)在珙桐種子萌發(fā)的過程中，GA和KT的含量增加，NAA的含量也增加[9]。1976年德國先靈公司宣布TDZ (thidiazuron)合成，其化學(xué)名稱為N-苯基-N’-(1,2, 3-噻二唑-5基)-脲。國內(nèi)定名為噻苯隆。噻苯隆是一種新型高效的細(xì)胞分裂素用于組培能更好的促進(jìn)植物的芽分化，其誘導(dǎo)植物細(xì)胞分裂的作用是6-BA的100倍[10]。從表2的極差分析結(jié)果可以得出，在芽分化及生根的過程中GA和TDZ起到了重要的作用，與陳坤榮、雷濘菲等研究的結(jié)果一致[3,9]。然而，本研究所得到的發(fā)生芽分化及生根的成熟胚的比例偏小，這可能與加入的外源激素的量有關(guān)。增加外源激素的加入量是否能促進(jìn)芽分化及生根有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

表3 芽分化及生根培養(yǎng)基正交設(shè)計(jì)方案、結(jié)果及極差分析

3 結(jié)論與討論

本研究通過兩步法即芽誘導(dǎo)、芽分化及生根，實(shí)現(xiàn)了珙桐種子直接再生植株。α-萘乙酸（NAA）、噻苯隆(TDZ)、赤霉素(GA)和活性炭(AC)在再生植株形成的不同階段發(fā)揮的作用有所差異。在下胚軸變綠、子葉變綠階段，AC和NAA起了主導(dǎo)作用，GA在萌發(fā)階段開始起主導(dǎo)作用，這種作用一直持續(xù)到形成完整植株。在芽分化及生根的過程中，TDZ也成為決定芽分化的主要因素，此時(shí)活性炭變?yōu)橐环N次要因素。本研究取材的時(shí)間是9月初，未成熟胚中萌發(fā)抑制物尚少，是本研究較高的未成熟胚萌發(fā)率得以實(shí)現(xiàn)的前提條件，然而所取的珙桐果實(shí)在冰箱中放置時(shí)間超過兩周后，就會(huì)造成種子生活力嚴(yán)重下降，未成熟胚萌發(fā)率嚴(yán)重降低。因此采用此法獲得珙桐的再生植株，珙桐果實(shí)的保存是今后需要解決的問題。

通過本研究得到了芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基0.09mg/L NAA+0.6 mg/L TDZ+0.9 mg/L GA+0.8 g/L AC+WPM培養(yǎng)基，此時(shí)未成熟胚萌發(fā)率為71.43%；芽分化及生根的最佳培養(yǎng)基為0.1 mg/L NAA+3 mg/ LTDZ+6 mg/L GA+1.2g/L AC+WPM培養(yǎng)基，此時(shí)再生植株的比例為50%。通過極差分析，得到了芽誘導(dǎo)階段的最佳培養(yǎng)基組合，然而由于材料的限制未能得到驗(yàn)證。

鄒利娟等采用組織培養(yǎng)的方法成功的繁殖珙桐苗，且幼苗成活率高達(dá)60%[11]，因此作為快繁技術(shù)未成熟胚再生植株因?yàn)槌杀靖撸〔臅r(shí)間受限，及材料保存困難受到限制。然而本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果卻為研究珙桐胚的形態(tài)后熟和生理后熟提供了良好的材料。激素及萌發(fā)抑制物質(zhì)的對(duì)胚的萌發(fā)及芽分化和生根的調(diào)控有待進(jìn)一步的研究。

注釋及參考文獻(xiàn)：

[1]傅立國．中國植物紅皮書(第一冊(cè))[M]．北京:科學(xué)出版社．1991:474-475．

[2]賀金生,林潔,陳偉烈．我國珍稀特有植物珙桐的現(xiàn)狀及其保護(hù)[J]．生物多樣性．1995,3(4):213-221．

[3]陳坤榮,李桐森,田廣紅,等．珙桐繁殖的生物學(xué)特性[J]．西南林學(xué)院學(xué)報(bào),1998,18(2):8-13．

[4]萬朝琨．珙桐種子休眠的解剖學(xué)研究[J]．中南林學(xué)院學(xué)報(bào),1988,8(1):35-39+114-115．

[5]余阿梅,蘇智先,王立強(qiáng),等．珍稀瀕危植物珙桐胚的萌發(fā)與快速繁殖[J]．植物學(xué)報(bào),2009,44(4):491-496．

[6]董社琴,李冰雯,王愛榮．植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)珙桐種胚離體培養(yǎng)的影響[J]．湖北農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)2004,24(4)：291-294．

[7]雷濘菲,蘇智先,陳勁松,等．珍稀瀕危植物珙桐果實(shí)中的萌發(fā)抑制物質(zhì)[J]．應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2003,9(6):607-610．

[8]蘇智先,張素蘭．珙桐種群生殖物候及其影響因子研究[J]．四川師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1999,20(4):4-9．

[9]雷濘菲,彭書明,牛蓓,等．珍稀瀕危植物珙桐種子休眠萌發(fā)過程中內(nèi)源激素的變化[J]．廣西植物,2009,29(1):66-69+131．

[10]劉承德,成磊．新型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑噻苯隆機(jī)理作用及應(yīng)用[J]．新疆農(nóng)墾科技,2011,2:63-64．

[11]鄒利娟,蘇智先,胡進(jìn)耀,等．瀕危植物琪桐的組織培養(yǎng)與植株再生[J]．植物研究,2009,29(2):187-192．

In Vitro Embryo Germination and Plant Regeneration from Immature Embryos of Davidia Involucrata Baill

FANG Zhi-rong,CAI Guang-ze
(Xichang College,Xichang,Sichuan 615013)

In order to obtain Davidia involucrata generation system,the immature embryos of D.involucrata were taken as explants,and regenerated plants were obtained.Four factors(α-Naphthaleneacetic acid[NAA], Thidiazyron[TDZ],gibberellic acid[GA]and active carbon[AC]affecting plant regeneration from immature embryos of D.involucrata were studied by use of orthogonal design and analyzed by range analysis.The results showed that: the best combination medium for embryo germination was WPM+0.09 mg/L NAA+0.6 mg/L TDZ+0.9 mg/L GA+1 g/L AC,and the germination rate were 71.43%.While the best combination medium for embryos grew into shoots and rooted was WPM+0.1 mg/L NAA+3 mg/L TDZ+6 mg/L GA+1.2 g/L AC,and the generation rates was 50%. AC could promote turning green of hypocotyls and cotyledon.NAA and GA were important to break after-ripening of embryo.GA and TDZ played a leading role in growing shoots and roots.

Davidia involucrate Baill;immature embryo;plant regeneration

Q943．1

A

1673-1891（2015）01-0007-04

2014-10-15

四川省教育廳項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：08zb015）；西昌學(xué)院院自立項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：ZZSSA0808）。

方志榮（1981-），女，講師，在讀博士，研究方向：植物學(xué)。