孟峻，侯艷軍，張永梅，呼格吉樂，劉洋，宿瑞俊

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，呼和浩特 010050）

14-3-3蛋白是一類廣泛存在于真核生物體內(nèi)、分子量約為28～33kDa的酸性蛋白質(zhì)［1］。14-3-3蛋白家族成員是在1967 年由Moore和Perez［2］首次在哺乳動(dòng)物的腦組織中發(fā)現(xiàn)并鑒定，按照蛋白質(zhì)的系統(tǒng)分類命名法命名為14-3-3蛋白。隨著對(duì)14-3-3蛋白的深入研究，發(fā)現(xiàn)它不僅僅是一種存在于腦組織中的蛋白，而且也廣泛存在于其他各種組織中。14-3-3蛋白高度保守，在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)7個(gè)家族成員，分別為β，γ，ε，σ，ζ，τ和η，并且由7個(gè)不同的基因編碼［3-4］。近年來，有大量關(guān)于人和小鼠的14-3-3蛋白通過細(xì)胞分裂周期磷酸酶25B（Cdc25B）調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的報(bào)道，且成為研究的熱點(diǎn)［5-6］。已有 文 獻(xiàn) 報(bào) 道［7-8］Cdc25B 能 使Cdc2（cell division cycle 2）上酪氨酸-15（Tyr-15）和蘇氨酸-14（Thr-14）脫磷酸從而激活Cdc2，促進(jìn)小鼠卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂。但是小鼠卵母細(xì)胞中是否表達(dá)14-3-3蛋白以及各亞型的表達(dá)情況目前國內(nèi)外未見文獻(xiàn)報(bào)道，而且在小鼠卵母細(xì)胞中14-3-3 蛋白是否通過Cdc25B磷酸酶調(diào)控小鼠卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂也知者甚少。本研究對(duì)小鼠卵母細(xì)胞14-3-3蛋白的表達(dá)亞型進(jìn)行鑒定，確定主要的表達(dá)亞型，以期為今后研究14-3-3蛋白調(diào)控小鼠卵母細(xì)胞G2／M 轉(zhuǎn)換中作用的研究做前期的準(zhǔn)備工作。

材料與方法

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF 級(jí)昆明系小白鼠，雌性3～4周齡，由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。動(dòng)物飼養(yǎng)溫度20～22℃，濕度50%～70%，光照周期12h／12h，自由進(jìn)食和飲水。

2.實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑：M2培養(yǎng)液、礦物油、丙酮酸鈉（Sigma，美國），Waymouth MB 752／1（Invitrogen，美國），孕馬血清促性腺激素（PMSG，寧波激素三廠），快速微量mRNA 提取純化試劑盒（GE Healthcare，美國），RNA PCR Kit（AMV）Ver3.0（TakaRa，日本），ECL 發(fā)光試劑盒（Pierce，美國），兔抗小鼠14-3-3ε抗體（Abcam，英國），山羊抗小鼠14-3-3β抗體（Cell signaling，美國），HRP 偶聯(lián)的兔抗山羊IgG 或羊抗兔IgG 二抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），兔抗小鼠β-Actin抗體（Santa Cruz，美國），PCR 擴(kuò)增引物的合成與DNA 測(cè)序均由上海生工公司完成。

二、研究方法

1.小鼠卵母細(xì)胞的采集和培養(yǎng)：根據(jù)Zhang等［7］的方法進(jìn)行小鼠超排卵、收集和培養(yǎng)。3～4周齡的昆明系雌性白鼠，腹腔注射孕馬血清（PMSG）10U／只，48h后脫頸法處死，快速取出卵巢，放于M2培養(yǎng)液（含125μmol／L 二丁烯環(huán)一磷酸腺苷，防止生發(fā)泡破裂）中，在體視顯微鏡下用1ml注射器針頭將卵巢撕碎，讓卵母細(xì)胞自然流出，用口吸管反復(fù)吹打去除附著的顆粒細(xì)胞，獲得裸卵母細(xì)胞，即GV 期卵母細(xì)胞，在PBS中洗3次，取一半GV 期卵母細(xì)胞用于mRNA 的提取，另一半GV 期卵母細(xì)胞在MB培養(yǎng)液［7］（在Waymouth MB752／1培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上添加100μg／ml丙酮酸鈉，50U／ml青霉素，50μg／ml鏈霉素，3 mg／ml BSA，此培養(yǎng)液簡(jiǎn)稱為MB培養(yǎng)液）中培養(yǎng)，上覆礦物油以防蒸發(fā)，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)以獲得生發(fā)泡破裂期（GVBD）卵母細(xì)胞，提取mRNA。

2.提取總mRNA：將100 個(gè)GV／GVBD 期卵母細(xì)胞收集到2ml離心管中，按EllustraTMQuick-Prep MicromRNA Purification試劑盒（GE Healthcare，美國）說明書進(jìn)行：主要包括：樣品的提取，mRNA 的分離，分別用高鹽緩沖液和低鹽緩沖液對(duì)已結(jié)合mRNA 的oligo（dT）纖維顆粒的洗滌，mRNA的洗脫。

3.引物設(shè)計(jì)：根據(jù)NCBI網(wǎng)站Blast對(duì)7個(gè)14-3-3亞型進(jìn)行引物設(shè)計(jì)

表1 檢測(cè)14-3-3各個(gè)亞型的引物序列

4.RT-PCR 法 檢 測(cè)mRNA 水 平：用TaKaRa RNAPCR（AMV）ver 3.0試劑盒，按操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR，RT-PCR 反應(yīng)體系為MgCl22μl，10×RTbuffer 1μl去酶dH2O 3.75μl，逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，dNTP 1μl，酶抑制劑0.25μl，dT-adaptor primer 0.5μl，mRNA 1μl，補(bǔ)ddH2O 至10μl，反應(yīng)條件為：42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min。PCR反應(yīng)體系為5×PCR buffer 5μl，Taq 酶0.15μl，上游引物（20pmol／L）0.25μl，下游引物（20pmol／L）0.25μl，cDNA模板5μl，補(bǔ)ddH2O 至25μl，反應(yīng)條件是：94℃，3min；循環(huán)為94℃30s，50℃30s，72℃1min，30～31 個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

5.Western蛋白印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平：收集GV 期和GVBD 期的小鼠卵母細(xì)胞各200枚，轉(zhuǎn)移到1.5ml Eppendorf管中，4℃離心去除培養(yǎng)液，加入20μl蛋白提取緩沖液，反復(fù)凍融裂解，加入SDS 樣 品 緩 沖 液，100℃煮 沸5 min，12% SDSPAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的Tris-HCl緩沖液＋Tween20（TBST）（pH7.4）室溫封閉1～2h。封閉后的濾膜與山羊抗小鼠14-3-3β抗體（1∶1 000稀釋）或兔抗小鼠14-3-3ε抗體（1∶800稀釋）及內(nèi)參β-Actin抗體（1∶200稀釋）4℃孵育過夜。HRP偶聯(lián)的兔抗山羊IgG 或羊抗兔IgG 作為二抗，室溫孵育2h。洗膜后，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（ECL detection kit，Millipore，美國）顯影成像。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3～4次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間差異采用t 檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)（Chi-square test）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、小鼠卵母細(xì)胞中7 個(gè)14-3-3 蛋白亞型的mRNA 表達(dá)水平的檢測(cè)

結(jié)果顯示，小鼠GV 期卵母細(xì)胞中在mRNA 水平上只有14-3-3β和14-3-3ε亞型存在，而且14-3-3ε mRNA 水平顯著高于14-3-3β（P＜0.01）（圖1）。14-3-3ε的mRNA 表 達(dá) 在GV 期 和GVBD 期 差 異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2）。

圖1 小鼠GV 期卵母細(xì)胞中7個(gè)14-3-3亞型mRNA 表達(dá)比較

圖2 小鼠GV、GVBD 期卵母細(xì)胞中14-3-3ε的mRNA 表達(dá)

二、小鼠卵母細(xì)胞中的14-3-3ε和14-3-3β蛋白表達(dá)水平

在小鼠GV 期和GVBD 期卵母細(xì)胞中又進(jìn)一步檢測(cè)了14-3-3ε和14-3-3β的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，GV 期和GVBD 期卵母細(xì)胞中14-3-3ε的蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3），這與mRNA 表達(dá)結(jié)果一致。14-3-3β 蛋白的表達(dá)非常低，Western blotting沒有檢測(cè)到14-3-3β蛋白的存在（圖4）。

圖3 小鼠GV 期和GVBD 期卵母細(xì)胞中14-3-3ε蛋白的表達(dá)水平

圖4 小鼠GV 期和GVBD 期卵母細(xì)胞中14-3-3β蛋白的表達(dá)水平

討 論

小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育成熟過程中停滯于生發(fā)泡期，也稱GV 期，相當(dāng)于有絲分裂的G2 期末［9］，在激素的刺激下，部分卵母細(xì)胞發(fā)生生發(fā)泡破裂（GVBD），即恢復(fù)第一次減數(shù)分裂。對(duì)爪蟾卵母細(xì)胞的研究表明［10-12］，在GV 期阻滯的卵母細(xì)胞中，減數(shù)分裂的啟動(dòng)子M 期促進(jìn)因子（MPF）的催化亞基Cdc2-Thr14／Tyr15被磷酸化，MPF 的活性受到抑制，PKA（蛋白激酶A）可直接磷酸化Cdc25的287位絲氨酸，此位點(diǎn)磷酸化后導(dǎo)致14-3-3 蛋白的結(jié)合，Cdc25 活性受抑，不能入核使Cdc2 的Thr14／Tyr15脫磷酸，因而不能激活MPF，卵母細(xì)胞發(fā)生GV 期阻滯。小鼠卵母細(xì)胞的研究證實(shí)，PKA 通過Cdc25B的321位絲氨酸磷酸化修飾引起GV 期阻滯，PKA／Cdc25B通路在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中發(fā)揮重要作用，Cdc25B 能促進(jìn)減數(shù)分裂的重新啟動(dòng)，其突變體（S321A）能完全解除PKA 引起的GV期阻滯［13-15］。然而，小鼠卵母細(xì)胞中是否存在14-3-3蛋白以及14-3-3蛋白是否與Cdc25B 結(jié)合而使小鼠卵母細(xì)胞阻滯于GV 期（相當(dāng)于有絲分裂的G2期），國內(nèi)外未見報(bào)道。本研究以小鼠卵母細(xì)胞為研究對(duì)象，利用分子生物學(xué)技術(shù)和方法鑒定了小鼠GV 期卵母細(xì)胞中14-3-3蛋白各亞型的表達(dá)情況，證實(shí)了小鼠卵母細(xì)胞中確實(shí)表達(dá)14-3-3蛋白，而且14-3-3ε是主要的表達(dá)亞型。最近我們課題組通過質(zhì)譜分析證實(shí)PKA 在體外能磷酸化小鼠Cdc25B的321位絲氨酸［16］，即Cdc25B是PKA 的直接作用底物。Uchida等［17］人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HEK293細(xì)胞中14-3-3ε能與Cdc25B 的309 位絲氨酸結(jié)合并且控制Cdc25B 的細(xì)胞質(zhì)定位。結(jié)合以前的研究［13-15，18］，我們可以推測(cè)：在小鼠GV 期卵母細(xì)胞中PKA 磷酸化Cdc25B 的321位絲氨酸后與14-3-3ε結(jié)合，二者共定位于細(xì)胞質(zhì)，Cdc25B 不能入核使Cdc2的Thr14／Tyr15脫磷酸，因而不能激活MPF，卵母細(xì)胞阻滯于GV 期。文獻(xiàn)［7］報(bào)道，在小鼠GV期卵母細(xì)胞中Cdc25B 定位于細(xì)胞質(zhì)，GVBD 前Cdc25B定位于細(xì)胞核，GVBD 后定位于整個(gè)細(xì)胞；Cdc25B的突變體Cdc25B-S321A 在GV 期不能定位于細(xì)胞質(zhì)而是定位于細(xì)胞核。上述實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步暗示14-3-3ε可能和磷酸化S321-Cdc25B 結(jié)合于小鼠卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，Cdc25B 不能入核，使卵母細(xì)胞阻滯于GV 期。這只是我們提出的假設(shè)，需要進(jìn)一步的后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明。

總之，本研究證實(shí)了小鼠GV 期卵母細(xì)胞中14-3-3ε的表達(dá)，這為我們今后研究PKA／Cdc25B／14-3-3ε通路在小鼠卵母細(xì)胞GV 期阻滯中作用的研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，這一通路的研究對(duì)小鼠一細(xì)胞期受精卵發(fā)育機(jī)制的研究具有重要的參考價(jià)值，為人類輔助生殖技術(shù)尤其是不孕不育的治療提供了理論基礎(chǔ)。

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