曾勇，梁佩燕，刁梁輝，趙明，黃春宇，陳偉洪，金燕，陳現(xiàn)

（深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045）

目前全球不孕不育的發(fā)病率約為育齡夫婦的9%，并有逐年升高的趨勢［1］。IVF-ET 及其衍生技術是一種有效的治療方法，它的迅速發(fā)展提高了不孕癥治療的成功率。該技術發(fā)展20多年來，盡管臨床促排卵方案及胚胎培養(yǎng)技術有了很大的改善，但IVF-ET 成功妊娠率仍徘徊在30%～50%［2］，其治療效果遠未達到人們的期望。在排除高齡、遺傳、內(nèi)分泌和解剖結構等異常因素后，仍有15%左右的不孕患者病因不明［3］，通常這部分患者被定義為不明原因不孕（UI）患者。如何改變UI患者的治療結局、提高胚胎成功種植率一直是該領域專家和學者們所關注的熱點問題。近年來，生殖免疫學研究表明胚胎種植失敗可能與母體的免疫狀態(tài)異常有關［4］，自身免疫因素在胚胎種植失敗患者中所起的作用已逐漸引起人們的重視。大量研究資料表明自身抗體如抗核抗體（ANA）、抗心磷脂抗體（aCL）和抗β2 糖蛋白I抗體（aβ2-GPI）的存在可能與復發(fā)性流產(chǎn)和反復種植失敗有關［5-7］，但與UI的關系尚不明確。因此，本研究通過聯(lián)合檢測并分析UI患者血清中的ANA、aCL 和aβ2-GPI三項指標，綜合判斷對UI的臨床應用價值，為尋找UI患者的致病因素提供新的診斷指標。

材料與方法

一、研究對象

本研究選取2015年1 月～4 月首次在本院生殖醫(yī)學中心接受IVF-ET 標準方案的108例UI患者作為研究對象即UI組。所有患者均經(jīng)過詳細詢問病史、全身及婦科檢查、染色體核型分析、宮腔感染和宮腔鏡以及內(nèi)分泌等系統(tǒng)性檢查，入選標準為：（1）年齡≤35歲；（2）卵巢儲備功能正常；（3）夫婦雙方染色體核型正常，女方無感染、子宮解剖結構正常、內(nèi)分泌正常、無輸卵管堵塞；（4）男方精液常規(guī)檢查正常；（5）無自身免疫疾病史；（6）無手術史和激素治療史；（7）原發(fā)不孕。同時選取在本中心工作的具有正常妊娠史的女性，共24 例為對照組，年齡為21～35歲。

所有患者在IVF-ET 進周前當月的月經(jīng)周期第3～5天抽取周圍血，正常對照組在同期抽取周圍血，采血后離心分離血清，分別檢測血清中ANA、aCL和aβ2-GPI抗體水平。本研究入選患者和正常對照的志愿者均簽署了檢測項目知情同意書，實驗流程獲得醫(yī)院學術與倫理學委員會許可。

二、實驗設備和試劑

實驗設備主要包括Luminex 200蛋白液相芯片系統(tǒng)（Luminex，美國）和Bio Tek Eon 微孔板分光光度計（BioTek，美國）。試劑主要包括AtheNA Multi-LyteTM抗核抗體檢測試劑盒（Zeus，美國），抗心磷脂抗體IgG／IgM 測定試劑盒（Inova，美國）和抗β2 糖蛋白I抗體IgG／IgM 檢測試劑盒（Inova，美國）。

三、實驗方法

1.ANA 譜檢測：ANA 譜的檢測應用多重微珠免疫法，采用AtheNA Multi-LyteTM抗核抗體檢測試劑盒檢測患者血清中9個ANA 標志物，包括抗干燥綜合征抗原A 抗體（SSA）、抗干燥綜合征抗原B抗體（SSB）、抗小核糖核蛋白抗體（Sm）、抗核糖核蛋白抗體（RNP）、抗硬皮病70 抗體（Scl-70）、抗組氨酰合成酶轉運核糖核酸抗體（Jo-1）、抗著絲點蛋白B抗體（CentB）、抗組蛋白抗體（AHA）和抗雙鏈DNA 抗體（dsDNA）。血清先用稀釋液按1∶21進行稀釋，向各孔中加入50μl微珠懸浮液，再將已1∶21稀釋的樣本各取10μl依次加入到微孔板中，室溫孵育30min后清洗微球，去除不反應的血清蛋白。每孔中加入150μl PE 標記的羊抗人IgG，混勻，室溫孵育30 min，通過Luminex 200 對微球懸浮液進行分析。同時利用內(nèi)校正技術，內(nèi)對照顆粒上的熒光信號可以將讀到的熒光強度轉換成濃度（單位）結果。陽性判斷標準：各單個ANA 濃度＞120U／ml定義為陽性。ANA 譜中9個標志物中的一個或幾個同時陽性均視為ANA 陽性。

2.aCL和aβ2-GPI IgG／IgM 檢測：aCL 和aβ2-GPI的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法。血清先用稀釋液按1∶101進行稀釋，再往預包被板中依次加入標準品、質控品和待測樣品100μl，室溫孵育30min，洗板3次；每孔中加入100μl抗人IgG／IgM HRP 結合物，室溫避光孵育30min，洗板3次；每孔中加入100μl TMB溶液（3’3’5’5-四甲基聯(lián)苯胺溶液），孵育30min后，加入100μl終止液終止反應。于波長450nm 處讀取OD 值，用折線擬合方式計算各樣品濃度值。陽性判斷標準：aCL-IgG≥20GPL／ml、aCLIgM≥20 MPL／ml，或aβ2-GPI-IgG≥20SGU、aβ2-GPI-IgM≥20SMU 定義為陽性。

四、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對UI患者組和正常對照組基線資料進行獨立樣本t檢驗分析，兩組自身抗體陽性率進行χ2檢驗分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

結 果

一、UI患者與對照組基本資料

資料顯示，年齡、身體質量指數(shù)（BMI）以及基礎內(nèi)分泌激素等可能對自身抗體陽性的風險具有一定的影響，所以我們比較了UI組和對照組的基本資料。與對照組相比，UI組的年齡、身體質量指數(shù)（BMI）、雌二醇（E2）、促黃體生成素（LH）、促卵泡雌激素（FSH）、泌乳素（RPL）和孕酮（P）的表達水平均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（表1）。

二、UI患者血清中ANA 的檢測結果

UI患者血清中ANA 總的陽性率為14.8%，其中抗SSA、SSB、Sm、RNP、Scl-70、Jo-1、CentB、AHA、dsDNA 等 抗 體 的 陽 性 率 分 別 為7.4%（8／108）、1.9%（2／108）、0、0.9%（1／108）、0.9%（1／108）、3.7%（4／108）、0.9%（1／108）、1.9%（2／108）和0，正常對照組中無一例ANA 陽性。兩組ANA總陽性率相比，具有顯著性差異（P＜0.05），而兩組間相應的單一抗體比較均無顯著性差異（P ＞0.05）。

三、UI患者血清中aCL檢測結果

UI患者血清中aCL 總陽性率為38.0%，其中aCL-IgG、aCL-IgM 和aCL-IgG-IgM 抗體陽性率分別 為25.0%、9.3% 和3.7%。aCL 總 陽 性 率 和aCL-IgG 抗體陽性率均顯著高于對照組（P ＜0.05），而aCL-IgM 和aCL-IgG-IgM 抗體陽性率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2）。

四、UI患者血清中aβ2-GPI檢測結果

結果所示，UI患者血清中aβ2-GPI總陽性率為9.3%，其中aβ2-GPI-IgG、aβ2-GPI-IgM 和aβ2-GPIIgG-IgM 抗體陽性率分別為0、9.3%和0，與正常對照組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表3）。

表1 UI組與正常對照組基本資料比較［±s］

表1 UI組與正常對照組基本資料比較［±s］

組 別 例數(shù) 年齡（歲） BMI（kg／m2） E2（pmol／L） LH（U／L） FSH（U／L） PRL（mU／L） P（nmol／L）UI組 108 30.5±2.9 21.1±1.9 133.6±13.4 4.2±1.6 6.1±1.5 318.1±86.0 0.9±0.1對照組 24 29.3±2.9 21.1±2.4 124.8±11.1 4.4±1.6 6.8±1.6 358.3±92.5 1.2±0.2

表2 UI組與正常對照組aCL陽性率比較［% （n）］

表3 UI組與正常對照組aβ2-GPI陽性率比較［%（n）］

討 論

近年來隨著生殖免疫學的研究進展，免疫因素和不孕不育的關系日益受到人們的重視，一種或多種自身抗體的存在常反映機體自身免疫狀態(tài)的異常，而不利于女性生殖健康。自身抗體如ANA、aCL和aβ2-GPI被認為可能是引起不孕不育癥、復發(fā)性流產(chǎn)和其它一些妊娠并發(fā)癥的重要因素［8］。但是，ANA、aCL和aβ2-GPI這3種抗體與UI的潛在相關性目前報道較少。因此，本研究希望通過檢測和分析UI患者血清中ANA、aCL 和aβ2-GPI的陽性率，明確ANA、aCL和aβ2-GPI是否可作為UI患者行IVF-ET 前病因篩查的檢測指標。

ANA 是一組對自身真核細胞內(nèi)的DNA、RNA、蛋白質和可提取的核抗原等作為靶抗原的自身抗體的總稱［9］。ANA 可穿透細胞膜進入活細胞中，產(chǎn)生抗體介導的細胞毒作用，中斷細胞有絲分裂進程，使 得DNA 合 成 受 阻［10］。Ying 等［11］研 究 發(fā)現(xiàn)ANA 可影響卵母細胞成熟和早期胚胎細胞分裂，其ANA 陽性組MII卵細胞比率、2PN 受精卵比率、卵裂率和可用胚胎以及優(yōu)質胚胎數(shù)量都顯著低于ANA 陰性組，并且胚胎種植率和臨床妊娠率也顯著降低，由此作者認為ANA 對卵母細胞成熟和胚胎細胞分裂的影響，可能是胚胎在種植前便成為了ANA 攻擊的目標。這些結果提示以細胞核成分為主要靶目標的ANA 很有可能是引起胚胎種植失敗的重要原因。ANA 與包括復發(fā)性流產(chǎn)和反復IVF-ET 失敗等在內(nèi)的多種不良妊娠結局密切相關，在復發(fā)性流產(chǎn)患者中，ANA 陽性率可高達50%［12］，在反復IVF-ET 失 敗 患 者 中ANA 的 陽 性率為35.1%［13］，另外，在IVF-ET 不孕患者中ANA陽性率為20%～28.7%［14-15］，而本研究結果顯示，UI患者ANA 總陽性率為14.8%，與對照組相比具有顯著性差異。由此推測，ANA 陽性可能與UI有關。

aCL是抗磷脂抗體（aPLs）的標志性抗體之一，主要以血小板和內(nèi)皮細胞膜上帶負電荷的心磷脂為靶抗原，在正常生理條件下不存在，一般出現(xiàn)在組織炎癥、粘連及損害后，可引起血管內(nèi)血栓形成，從而引發(fā)胎盤與蛻膜血流不暢以及供血不足等情況，最終導致流產(chǎn)［16］。aCL 引 起IVF 種 植失 敗 的 可 能 作用機理為［17］：（1）aCL在卵泡液中聚集，并粘附到卵母細胞細胞表面，從而干擾卵母細胞形成；（2）aCL可直接結合到胚胎上，導致胚胎發(fā)育延滯和胚胎形態(tài)異常；（3）aCL可抑制子宮內(nèi)膜的蛻膜化，降低子宮內(nèi)膜容受性。目前普遍認為aCL 與復發(fā)性流產(chǎn)、先兆子癇、IVF-ET 失敗等生殖障礙疾病有關。本研究UI組aCL-IgG、aCL-IgM 和aCL-IgG-IgM 抗體陽性率分別為25.0%、9.3%和3.7%，與對照組相比，aCL-IgM 和aCL-IgG-IgM 抗體陽性率無顯著差異，但aCL總陽性率和aCL-IgG 抗體陽性率均顯著高于正常對照組（P＜0.05），由此我們推測aCL陽性，特別是aCL-IgG 抗體陽性可能與UI有關。本研究UI患者血清中aCL總陽性率與早期研究結果一致（42%）［18］，但顯著高于Radojcic′等［19］報道的aCL陽性率（23.8%）。這種差異性可能主要是由于陽性閾值的設定和檢測方法不同而引起的。

β2-GPI是由Ⅰ-Ⅴ五個共同序列的功能區(qū)即補體調(diào)控結構域構成的血漿蛋白質，Ⅰ和Ⅴ結構域可與帶負電荷的磷脂結合，主要以Ⅴ結構域為主導作用，而 以β2-GPI 為 靶 目 標 的aβ2-GPI 或aCL 等aPLs結合位點位于Ⅰ結構域。研究表明，β2-GPI作為最重要的aPLs結合輔因子，可與內(nèi)皮細胞、單核細胞、血小板、滋養(yǎng)層細胞和蛻膜細胞表面受體以及凝血因子相互結合，介導炎癥反應、細胞凋亡、內(nèi)皮細胞損傷、凝血功能異常等［20］。而aβ2-GPI一方面在血栓形成過程中具有致病作用，可干擾β2-GPI的抗凝血功能；另一方面，aβ2-GPI可與蛻膜細胞發(fā)生反應，誘導母體子宮內(nèi)膜促炎性狀態(tài)的發(fā)生，產(chǎn)生白 介 素-8 （IL-8）、IL-1 和 單 核 細 胞 趨 化 蛋 白-1（MCP-1）等促炎細胞因子，干擾胚胎著床，導致天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶（caspase）介導的滋養(yǎng)層細胞死亡，而引起妊娠失敗［21］。研究表明aβ2-GPI與IVF種植失敗和復發(fā)性流產(chǎn)患者等不良妊娠結局有關，其血清中aβ2-GPI抗體陽性率分別為9%和16%，均顯著高于正?？稍袐D女［5］。因此，本研究通過檢測UI患者和正常對照組血清中aβ2-GPI的陽性率，探討aβ2-GPI與UI的關系。檢測結果顯示aβ2-GPI的總陽性率為9.3%，其中aβ2-GPI-IgG、aβ2-GPI-IgM 和aβ2-GPI-IgG-IgM 抗體陽性率分別為0、9.3%和0，與正常對照組比較均無顯著性差異，由此推測，aβ2-GPI陽性可能與UI無關。

同時，大量的研究表明：對自身抗體ANA 和aCL陽性的IVF-ET 患者給予強的松和阿司匹林治療后，可顯著的提高胚胎種植率和臨床妊娠率［22-23］。而對自身抗體陽性的UI患者進行免疫干預治療的研究目前尚未見報道。因此，這有待于我們進一步深入的研究，以期更好的闡明自身抗體陽性對UI患者妊娠結局的影響，為UI的臨床治療提供理論依據(jù)。

綜上所述，UI患者血清中ANA 和aCL總陽性率顯著高于正常已孕婦女，這可能是UI患者不孕的重要因素之一，可作為UI病因篩查的重要檢測指標。

［1］ Boivin J，Bunting L，Collins JA，et al.International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking：potential need and demand for infertility medical care［J］.Hum Reprod，2007，22：1506-1512.

［2］ Check JH，Katsoff B，Wilson C，et al.Pregnancy outcome following fresh vs frozen embro transfer into gestational carriers using a simplified slow freeze protocol［J］.Clin Exp Obstet Gynecol，2012，39：23-24.

［3］ Forti G，Krausz C.Clinical review 100：Evaluation and treatment of the infertile couple［J］.J Clin Endocrinol Metab，1998，83：4177-4188.

［4］ Choudhury SR，Knap PLA.Human reproductive failure I：immunological factors［J］.Hum Reprod Update，2000，7：113-134.

［5］ Stern C，Chamley L，Hale L，et al.Antibodies to beta2 glycoprotein I are associated with in vitro fertilization implantation failure as well as recurrent miscarriage：results of a prevalence study［J］.Fertil Steril，1998，70：938-944.

［6］ Cline AM，Kutteh WH.Is there a role of autoimmunity in implantation failure after in-vitro fertilization？［J］Cur Opin Obstet Gynecol，2009，21：291-295.

［7］ Poulton K，Ripoll VM，Pericleous C，et al.Purified IgG from patients with obstetric but not IgG from non-obstetric antiphospholipid syndrome inhibit trophoblast invasion［J］.Am J Reprod Immunol，2015，73：390-401.

［8］ Shoenfeld Y，Blank M.Autoantibodies associated with reproductive failure［J］.Lupus，2004，13：643-648.

［9］ Fragkou IA，Mavrogianni VS，Cripps PJ，et al.The bacterial florain the teat duct of ewes can protect against and can cause mastitis［J］.Vet Res，2007，38：525-545.

［10］ Yanase K，Madaio MP.Nuclear localizing anti-DNA antibodies enter cells via caveoli and modulate expression of caveolin and p53［J］.J Autoimmun，2005，24：145-151.

［11］ Ying Y，Zhong YP，Zhou CQ，et al.Antinuclear antibodies predicts a poor IVF-ET outcome：impaired egg and embryo development and reduced pregnancy rate［J］.Immunol Invest，2012，41：458-468.

［12］ Ticconi C，Rotondi F，Veqlia M，et al.Antinuclear autoantibodies in women with recurrent pregnancy loss［J］.Am J Reprod Immunol，2010，64：384-392.

［13］ Kaider AS，Kaider BD，Janowicz PB，et al.Immunodiagnostic evaluation in women with reproductive failure［J］.Am J Reprod Immunol，1999，42：335-346.

［14］ Kikuchi K，Shibahara H，Hirano Y，et al.Antinuclear antibody reduces the pregnancy rate in the first IVF-ET treatment cycle but not the cumulative pregnancy rate without specific medication［J］.Am J Reprod Immunol，2003，50：363-367.

［15］ Taniguchi F.Results of prednisolone given to improve the outcome of in vitro fertilization-embryo transfer in women with antinuclear antibodies［J］.J Reprod Med，2005，50：383-388.

［16］ 彭瑤，黃紅梅，曾欽鳳.生殖免疫自身抗體檢測在婦科不孕不育診斷中的臨床價值評價［J］.醫(yī)學檢驗，2013，3：119-121.

［17］ Zhong YP，Ying Y，Wu HT，et al.Impact of anticardiolipin antibody on the outcome of in vitro fertilization and embryo transfer［J］.Am J Reprod Immunol，2011，66：504-509.

［18］ Roussev RG，Kaider BD，Price DE，et al.Laboratory evaluation of women experiencing reproductive failure［J］.Am J Reprod Immunol，1996，35：415-420.

［19］ Radojcic′L，Marjanovic′S，Vic′ovac L，et al.Anticardiolipin antibodies in women with unexplained infertility［J］.Physiol Res，2004，53：91-96.

［20］ Willis R，Pierangeli SS.Anti-β2-glycoprotein I antibodies［J］.Ann N Y Acad Sci，2013，1285：44-58.

［21］ Meroni PL，Borghi MO，Raschi E，et al.Pathogenesis of antiphospholipid syndrome：understanding the antibodies［J］.Nat Rev Rheumatol，2011，7：330-339.

［22］ Zhu Q，Wu L，Xu B，et al.A retrospective study on IVF／ICSI outcome inpatients with anti-nuclear antibodies：the effectsof prednisone plus low-dose aspirin adjuvanttreatment［J］.Reprod Biol Endocrinol，2013，11：98.

［23］ Geva E，Amit A，Lerner-Geva L，et al.Prednisone and aspirin improve pregnancy rate in patients with reproductive failure and autoimmune antibodies：aprospective study［J］.Am J Reprod Immunol，2000，43：36-40.