董勝男，劉煒，王炎秋，周圍，石禮紅，趙起越，謝曉東，紀(jì)亞忠＊

（1.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，上海 200065；2.山東建筑大學(xué)附屬校醫(yī)院，濟(jì)南 250101）

多胚胎移植可提高臨床妊娠率，但易致多胎妊娠，影響母嬰安全及健康。為減少多胎妊娠，目前國內(nèi)外部分生殖醫(yī)學(xué)中心已調(diào)整為移植2枚［1］、甚至1枚［2］胚胎。另有臨床數(shù)據(jù)表明，胚胎質(zhì)量與臨床妊娠率存在相關(guān)性，但不同胚胎質(zhì)量對活產(chǎn)率的影響仍有爭議［3］。本文回顧了我中心第3天、二枚胚胎移植的相關(guān)數(shù)據(jù)，按照胚胎的形態(tài)學(xué)分級，分別對各組間患者年齡、不育年限、不育因素以及臨床妊娠率、抱嬰率、活產(chǎn)率等臨床結(jié)局進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

資料與方法

一、研究對象與分組

選取2012年6月至2014年5月在上海市同濟(jì)醫(yī)院生殖中心行兩枚第3天胚胎移植的所有夫婦。入選的標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）夫妻雙方染色體正常且有IVF／ICSI指征的患者；（2）女方年齡不超過35歲；（3）移植2枚第3天胚胎且移植胚胎質(zhì)量為Ⅰ～Ⅲ級；（4）移植當(dāng)天內(nèi)膜厚度為7mm 及以上；（5）促排卵藥物為尿促卵泡素（麗申寶，珠海麗珠），根據(jù)患者情況，選用長方案、短方案及微刺激方案?？紤]麗申寶含有少量LH，促排卵中不加用人絕經(jīng)期促性腺素（HMG）。排除標(biāo)準(zhǔn)：包含受卵、自然周期取卵、卵母細(xì)胞凍融、囊胚移植的周期。將所有周期按照移植胚胎的組合不同分為3組：A 組為移植兩枚Ⅰ級胚胎；B組為移植一枚Ⅰ級胚胎和一枚低級別的胚胎；C組為移植兩枚非I級胚胎。

二、研究方法

1.取卵及卵細(xì)胞的處理：HCG 注射34～36h后在靜脈麻醉及B 超引導(dǎo)下經(jīng)陰道后穹窿穿刺取卵。取卵及卵母細(xì)胞傳遞過程中始終保持37℃。在倒置顯微鏡下拾卵，迅速將撿到的卵母細(xì)胞洗滌后放入平衡液（Irvine Scientific?，美國）［4］中。

2.精液的收集與處理：患者丈夫取精前禁欲3～5d，以手淫法將精液收集在潔凈的無菌干燥燒杯中，按WHO 的標(biāo)準(zhǔn)化精液分析法進(jìn)行常規(guī)精液分析，并留取精卡。經(jīng)密度梯度離心并洗滌兩次后置CO2培養(yǎng)箱獲能3～6h。

3.授精：取卵后4～6h后，行IVF 的患者，直接將精子加入含有卵母細(xì)胞的授精液（Irvine Scientific?，美國）。行ICSI的患者，首先將卵母細(xì)胞在透明質(zhì)酸酶中去除大部分顆粒細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移至體外操作液中將透明帶以外的全部顆粒細(xì)胞去除。在顯微注射臺(tái)上挑選單個(gè)優(yōu)質(zhì)的精子，制動(dòng)并注射入MⅡ的卵內(nèi)。

4.觀察原核：于授精后16～18h 用適當(dāng)口徑的拆卵針將IVF的卵母細(xì)胞除去顆粒細(xì)胞，在顯微鏡下檢查受精情況。正常受精的標(biāo)準(zhǔn)：見到2個(gè)獨(dú)立的或有碎片的極體，同時(shí)又有2個(gè)清晰的原核。

5.胚胎質(zhì)量評估和胚胎移植：授精后48h 檢查卵裂情況和胚胎分級。胚胎分級是根據(jù)卵裂球的數(shù)目、有無核碎片及其占整個(gè)胚胎的比例以及卵裂球大小是否均勻進(jìn)行劃分的［5-7］，將胚胎質(zhì)量分為Ⅰ～Ⅳ等級。Ⅰ級為≥7細(xì)胞，卵裂球均勻，無碎片或碎片小于整個(gè)胚胎的5%；Ⅱ級為≥7細(xì)胞，卵裂球大小均勻或稍不均勻，卵裂球碎片6%～15%；Ⅲ級為6細(xì)胞，碎片＜30%；Ⅳ級≥6細(xì)胞，碎片大于30%或≤5細(xì)胞；Ⅴ級2PN，未分裂的胚胎或碎片＞50%的胚胎。所有可移植胚胎不僅在形態(tài)學(xué)評分上滿足Ⅰ～Ⅲ級要求，且必須為2PN、連續(xù)生長的胚胎。

6.移植后黃體期支持和妊娠檢查：移植后常規(guī)使用黃體支持，從移植當(dāng)天開始持續(xù)至移植后72d或妊娠終止時(shí)。移植后14d查血β-HCG，陽性者2周后B超檢查胎囊、胎心情況。若沒有見胎心搏動(dòng)則一周后復(fù)查直至可見胎心搏動(dòng)或妊娠終止。生化妊娠是指血HCG 升高但未成功形成孕囊的周期，宮內(nèi)妊娠為血β-HCG 升高且B 超檢查見宮內(nèi)有妊娠囊，各臨床結(jié)局的計(jì)算見表2［8-10］。異位妊娠除非B 超下確認(rèn)孕囊個(gè)數(shù)，否則單側(cè)異位妊娠按1個(gè)孕囊種植計(jì)算。雙胎妊娠為異卵雙胎妊娠，單卵雙胎不納入計(jì)算。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20 統(tǒng)計(jì)軟件。3 組間計(jì)量資料用One-way ANOVA 分析以及t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、3組一般情況比較

共442對夫婦，517個(gè)周期納入研究。A 組包含304個(gè)周期，女方平均年齡為（29.04±3.62）歲，平均不育年限為（3.90±2.44）年；B 組包含128個(gè)周期，女方平均年齡為（28.46±3.55），平均不育年限為（3.70±2.22）年；C 組包含85個(gè)周期，女方平均年齡為（29.47±3.96）歲，平均不育年限為（3.93±2.55）年。三組間年齡及不育年限的差異不顯著（P＞0.05）。分別將3組的不育因素按照不育原因分為男方因素、輸卵管因素、多囊卵巢、卵巢儲(chǔ)備功能下降、子宮內(nèi)膜異位癥和不明原因幾個(gè)亞類。經(jīng)比較，各組間不育因素構(gòu)成比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

二、妊娠結(jié)局

1.胚胎種植和胚胎活產(chǎn)情況：隨著胚胎組合形態(tài)學(xué)評級的下降，3組的臨床妊娠率、胚胎種植率和抱嬰率依次降低，A 組的臨床妊娠率、胚胎種植率和抱嬰率顯著高于B、C兩組（P＜0.05），B組的臨床妊娠率、胚胎種植率和抱嬰率均顯著高于C 組（P＜0.05）。A組的胚胎活產(chǎn)率分別高于B組和C組（P＜0.05），B、C組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

2.胚胎種植失敗和流產(chǎn)情況：3組間的生化妊娠率分別為6.7%、10.1%、15.9%；異位妊娠率分別為1.8%、1.3%、2.8%；早 期 流 產(chǎn) 率 為7.7%、11.4%、8.3%；晚期流產(chǎn)率為6.4%、5.1%、5.6%；3組間的異位妊娠率、早期流產(chǎn)率和晚期流產(chǎn)率兩兩之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；C 組的生化妊娠率顯著高于A 組和B組（P＜0.05），A、B 組間差異不顯著（P＞0.05）（表2）。

表1 3組基線資料比較［（±s），n（%）］

表1 3組基線資料比較［（±s），n（%）］

組 別 例數(shù) 女方年齡（歲）不育年限（年）不育原因男方因素 輸卵管因素 多囊卵巢綜合征卵巢儲(chǔ)備功能下降子宮內(nèi)膜異位癥不明原因不孕A 組 304 29.04±3.62 3.90±2.44 57（18.8） 215（70.7） 5（1.6） 18（5.9） 7（2.3） 2（0.7）B組 128 28.46±3.55 3.70±2.22 23（18.0） 86（67.2） 6（4.7） 12（9.4） 1（0.8） 0 C組 85 29.47±3.96 3.93±2.55 13（15.3） 56（65.9） 2（2.4） 11（12.9） 3（3.5） 0

表2 3組妊娠結(jié)局比較［%（n）］

3.雙胎情況：3 組的雙胎種植率分別為31.6%、18.0%、16.5%；雙 胎 分 娩 率 為38.6%、21.2%、41.9%。A 組的雙胎種植率顯著高于其它兩組（P＜0.05），B、C 組間雙胎種植率相似；C 組的雙胎分娩率均顯著高于其它兩組，A、B 組間并無顯著性差異（P＞0.05）（表2）。

三、胎兒性別比例

3組活產(chǎn)胎兒共386名，其中男嬰190名，女嬰196名?；町a(chǎn)胎兒的性別比例總體維持在1∶1.03。各組分別為：A 組73例雙胎，116例單胎，男嬰124名，女嬰138名；B組14例雙胎，52例單胎，男嬰44名，女嬰36名；C 組13例雙胎，18例單胎，男嬰22名，女嬰22名。

討 論

影響IVF-ET 妊娠結(jié)局的因素，除胚胎形態(tài)學(xué)分級 外［11］，還 涉 及 女 方 年 齡［12］、子 宮 內(nèi) 膜 的 容 受性、不孕不育因素［13］、促排卵方式［14］以及移植胚胎的數(shù)目等。本文選取女方年齡在35 歲以內(nèi)、移植2枚第3天胚胎的周期，所有周期使用的促排卵藥物均為麗申寶，移植當(dāng)天子宮內(nèi)膜厚度均在7 mm以上，三組在不育因素構(gòu)成比上無顯著性差異，且移植后黃體支持方法相同，所以本次研究的結(jié)果具有較好的可比性。

以往，為了提高妊娠率，人們往往移植多個(gè)胚胎。但是多個(gè)胚胎移植會(huì)增加多胎妊娠的危險(xiǎn)，增加高危妊娠發(fā)病率，危害母兒健康。因此必須采用一種較為可靠的方法鑒別胚胎質(zhì)量，以便在移植少量胚胎的情況下可獲得更高的妊娠率。本研究顯示，隨著Ⅰ級胚胎數(shù)目下降，臨床妊娠率和胚胎種植率呈逐級遞減的關(guān)系。胚胎形態(tài)學(xué)評級可以一定程度上反映胚胎的發(fā)育潛能，胚胎形態(tài)學(xué)分級越高，其臨床妊娠率和種植率會(huì)越高。此外，形態(tài)學(xué)評分較低胚胎的生化妊娠率遠(yuǎn)高于兩枚Ⅰ級胚胎的組別，提示低級別的胚胎往往會(huì)有更高著床失敗的比率。但由于本研究中非雙Ⅰ級胚胎的移植周期較少，特別是不含Ⅰ級胚胎的組別樣本量較小，這一結(jié)論尚有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，本研究顯示一旦胚胎成功種植形成孕囊后，胚胎形態(tài)學(xué)評分級對臨床妊娠結(jié)局并不產(chǎn)生影響，具體表現(xiàn)在各組的異位妊娠率、早期流產(chǎn)率、晚期流產(chǎn)率和活產(chǎn)率均相似，無顯著性差異。提示在胚胎種植形成孕囊后，不同評級的胚胎有相似比例的自然淘汰，且與自然流產(chǎn)率相近［15］。這可能與本研究納入的患者均為35歲以下有關(guān)。年齡是影響胚胎質(zhì)量的重要因素，高齡婦女的卵質(zhì)量和胚胎質(zhì)量往往較年輕婦女差［16］，其流產(chǎn)率和胎兒畸形率也較年輕婦女高。因此，這一結(jié)論有待于在不同的年齡分組中進(jìn)行驗(yàn)證。

目前評價(jià)胚胎的發(fā)育潛能主要為形態(tài)學(xué)上的鑒別，然而并不是所有形態(tài)理想的胚胎均能順利發(fā)育，形態(tài)欠佳的胚胎也可以孕育出健康的子代。有報(bào)道顯示，胚胎的早期分裂階段發(fā)育最初是由母源性的轉(zhuǎn)錄與貯存的信息來控制的，而并不是由真正的胚胎基因組控制［17］。因此，早期胚胎的形態(tài)學(xué)分級并不能完全地反映胚胎的發(fā)育潛能。此外，胚胎的形態(tài)學(xué)分級主要依靠顯微鏡下的肉眼觀察，故主觀性較強(qiáng)。因此，我們需要更精準(zhǔn)的胚胎評價(jià)體系來預(yù)測胚胎的發(fā)育潛能。目前正在研究其他一些評估胚胎質(zhì)量的無創(chuàng)檢測方法有形態(tài)動(dòng)態(tài)觀察［18］，胚胎代謝組學(xué)指標(biāo)的檢測，包括丙酮酸、氨基酸、葡萄糖的代謝、近紅外光譜評價(jià)胚胎代謝活動(dòng)力；胚胎內(nèi)源性因子的檢測，如可溶性人淋巴細(xì)胞抗原-G（sHLA-G）的檢測。有報(bào)道顯示胚胎外觀評分聯(lián)合以上某個(gè)指標(biāo)可提高臨床妊娠率，如sHLA-G［19］和紅外線代謝測量等［20］。此外，還有一些有創(chuàng)的胚胎評價(jià)方法，如單細(xì)胞基因檢測，可以剔除染色體異常的胚胎［21］。目前代謝物分析方法和技術(shù)平臺(tái)尚未完全建立，尚處于起步階段；單細(xì)胞基因檢測費(fèi)用高、技術(shù)難度大，目前還不能普遍推廣。但這些新興的技術(shù)均具有極大的發(fā)展?jié)摿?，隨著胚胎評價(jià)技術(shù)的發(fā)展，必定能制定出一套適合于第3天胚胎的且能高度預(yù)測胚胎存活的體系標(biāo)準(zhǔn)，以提高妊娠結(jié)局。

本文病例中，35歲以下年輕婦女的雙胎活產(chǎn)比例為35%。當(dāng)移植兩枚Ⅰ級胚胎時(shí)，雙胎率可達(dá)38.6%。結(jié)合本文的胚胎種植率和胚胎活產(chǎn)率，若僅移植一枚Ⅰ級第3天胚胎，35歲以內(nèi)女性的臨床妊娠率及活產(chǎn)率分別可達(dá)52.0%、43%左右。臨床妊娠率雖有降低，仍在可接受范圍內(nèi)，但可杜絕異卵雙胎的產(chǎn)生以及由此帶來的母嬰潛在的風(fēng)險(xiǎn)。

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