衛(wèi)程華，陳娟，許曼翎，戚雪勇

（江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

表面增強(qiáng)拉曼光譜法快速分析中藥三七的有效成分

衛(wèi)程華，陳娟，許曼翎，戚雪勇

（江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：建立表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）法快速分析中藥三七中的有效成分。方法：對(duì)三七藥材進(jìn)行簡單的預(yù)處理，分別測試三七藥材粉末、三七水提和醇提樣品的表面增強(qiáng)拉曼光譜；再結(jié)合薄層色譜分離技術(shù)，測試三七醇提取樣品中單一有效成分的表面增強(qiáng)拉曼光譜，并對(duì)所獲得的圖譜進(jìn)行解析。結(jié)果：直接測試三七藥材粉末、三七水提和醇提樣品的表面增強(qiáng)拉曼光譜有微弱信號(hào)；三七醇提取樣品經(jīng)過TLC技術(shù)分離后的單一組分可獲得較理想的表面增強(qiáng)拉曼光譜。結(jié)論：建立的快速分析三七有效成分的表面拉曼光譜法具有簡便，快速，專屬性好，靈敏度高等特點(diǎn)，可拓展到其他中藥材的質(zhì)量控制和分析鑒定中。

表面增強(qiáng)拉曼光譜；三七；快速分析

三七［Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen］，屬五加科人參屬多年生草本植物，為我國特有的名貴中藥材，分布在我國云南、廣西、江西、四川等地，主要藥用部位是其根部，具有散瘀止血，消腫定痛之功效［1］。三七成分復(fù)雜，主要藥用成分為人參皂苷［2］?，F(xiàn)在常用來分析三七的方法有薄層色譜法（TLC）［3］、高效液相色譜法（HPLC）［4］、核磁共振-質(zhì)譜聯(lián)用法（NMR-MS）［5］、超高效液相色譜法（UPLC）［6-7］等。

拉曼光譜（Raman spectra）是一種散射光譜，相對(duì)于常規(guī)分析方法，具有樣品前處理簡單、操作快速簡便、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，近年來在食品［8-10］、生物［11-12］、醫(yī)藥［13-14］等分析領(lǐng)域發(fā)展迅速。表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）具有增強(qiáng)振動(dòng)信號(hào)、低檢測限以及良好的吸附選擇性，因此在眾多領(lǐng)域的應(yīng)用分析上具有良好的發(fā)展?jié)摿Γ?5-16］。中藥三七成分復(fù)雜，常規(guī)的拉曼光譜直接測試效果不佳，熒光干擾較強(qiáng)。本研究建立了利用便攜式拉曼光譜儀快速測試三七中有效成分信號(hào)的表面增強(qiáng)拉曼光譜分析法，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)三七藥材的快速分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與測試條件

儀器：EZRamam-M便攜式拉曼光譜儀（EnWave Optronics公司）；Tecnai-12透射電子顯微鏡（飛利浦公司）；UV-2401PC紫外可見光分光光度計(jì)（日本島津公司）；BI-9000高濃度激光粒度分布儀（美國布魯克海文儀器公司）；SZCL-2數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器（杭州瑞佳精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；80-2離心沉淀器（金壇市醫(yī)療儀器廠）；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

拉曼測試條件：光譜測量范圍0～3 000 cm-1，CCD檢測器，光譜分辨率1 cm-1，積分時(shí)間30 s，平均積分2次。采用785 nm半導(dǎo)體激光作為激發(fā)光源，激光功率為500 mW。

1.2 藥材與試劑

藥材：20頭三七，產(chǎn)于云南，購于鎮(zhèn)江市存仁堂大藥房（安徽亳州市藥材總公司，批號(hào)：20130618），經(jīng)藥學(xué)院傅海珍老師鑒定為道地藥材。

試劑：硝酸銀（分析純，上海試劑一廠）；檸檬酸三鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；硅膠G薄層板（青島海洋化工）；甲醇、硫酸、三氯甲烷、乙酸乙酯、羅丹明B（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水均為實(shí)驗(yàn)室自制雙蒸水。

1.3 樣品處理

三七粉末：取原藥材，洗凈烘干（60℃）后切片，搗碎研磨，過200目篩即可。

三七水提樣品：稱取烘干后的三七藥材切片5 g，于燒杯中加水500 mL，浸泡30min，煎煮1 h后，兩層紗布過濾，取濾液。將濾液濃縮至100 mL后離心，取上清液于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

三七醇提樣品：取三七粉末5 g于具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL浸潤，超聲1 h后，靜置，取上清液于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 銀膠溶液的制備

參考Lee等［17］的方法，以檸檬酸三鈉還原硝酸銀制備銀納米粒子。將100 mL硝酸銀溶液（0.002 2 mol/L）于智能控溫磁力攪拌器上攪拌（1 000 r/ min）加熱到90℃，再逐滴加入2.6 mL檸檬酸三鈉溶液（0.039 mol/L），90℃恒溫?cái)嚢? h至溶液呈黃綠色。

1.5 拉曼掃描方法

三七粉末樣品：取少許三七粉末樣品于固體檢測架上，滴加適量銀膠溶液，待其成糊狀后刮平測試表面，進(jìn)行拉曼掃描。

三七水提/醇提取液樣品：取1 mL三七提取液（水/醇提?。┯谕该鳂悠菲恐?，滴加等體積的銀膠溶液，搖勻，10 min后進(jìn)行拉曼掃描。

三七醇提樣品TLC-SERS掃描：以三氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇：水=15∶40∶22∶10下層溶液為展開劑，點(diǎn)樣5μL，平行點(diǎn)數(shù)樣。待展距約為10 cm時(shí)取出薄層板，晾干。在距板面垂直10 cm左右，噴以10%稀硫酸溶液，晾干，置烘箱中（105℃）烘干至出現(xiàn)紫紅色斑點(diǎn)后取出，于每個(gè)斑點(diǎn)處滴加1滴銀膠溶液，迅速利用刮刀搜集紫色斑點(diǎn)處的硅膠粉末，平行斑點(diǎn)合并為一種樣品，分別獲得樣品A、B、C。如圖1所示。

圖1 TLC-SERS采樣示意圖

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)獲得的拉曼光譜圖均采用OriginLab公司出品的Origin 8.5軟件繪制，使用FFT-Filter平滑處理方式，平滑點(diǎn)數(shù)為5。

2 結(jié)果與討論

2.1 銀溶膠的表征

由于中藥材三七以及其提取物成分復(fù)雜、活性成分含量低等原因，銀膠溶液的質(zhì)量很可能對(duì)測試效果具有一定的影響，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)銀納米粒子的形態(tài)、大小、粒徑分布進(jìn)行了初步表征，并以羅丹明B為探針分子，檢測了自制銀膠的增強(qiáng)效果及其最低作用濃度。

2.1.1 紫外吸收光譜 圖2為檸檬酸三鈉還原硝酸銀制備了表面增強(qiáng)基底材料銀溶膠的紫外吸收光譜圖，全波長掃描范圍為200～800 nm。

圖2 銀膠紫外吸收光譜

銀膠的紫外吸收光譜反映了納米粒子表面等離子體共振吸收的譜峰和強(qiáng)度，它們與納米粒子的形狀、濃度、粒徑分布以及粒徑大小有關(guān)。譜峰的最大吸收位置可用來粗略表征銀粒子的粒徑，譜峰的波長越大，相應(yīng)的粒子半徑也越大；而譜峰的個(gè)數(shù)反映納米粒子的形狀，一般球形粒子只有1個(gè)吸收峰［18］。由圖2可知，在428 nm處有最大吸收，且為單峰，可初步判斷本實(shí)驗(yàn)制備的銀納米粒子為類球形粒子。

2.1.2 透射電鏡及粒徑分布 將自制銀溶膠經(jīng)預(yù)處理后于透射電子顯微鏡中檢視得到透射電鏡圖（圖3），可觀察到球形銀納米顆粒，粒徑在100 nm左右。圖4為銀納米粒子的粒徑分布圖，結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)自制銀膠納米粒子粒徑呈正態(tài)分布，平均粒徑為102.9 nm，分散性良好。

圖3 銀納米粒子電鏡圖

圖4 銀納米粒子粒徑分布圖

2.1.3 銀納米粒子的增強(qiáng)效果 以0.000 1 g/mL的羅丹明B為探針分子檢測銀膠溶液的增強(qiáng)效果，結(jié)果見圖5a，同一質(zhì)量濃度的羅丹明B與不同存放時(shí)間的銀膠所獲得的SERS圖譜有明顯不同，新制銀膠與存放24 h后的銀膠相比峰信號(hào)較強(qiáng)，圖譜更豐富，而存放48 h后的銀溶膠幾乎不具有增敏作用，銀膠存放時(shí)間久可能有沉降和聚集，影響增敏效果，所以本實(shí)驗(yàn)中增敏材料均采用新制銀膠；另外，0.000 1 g/mL羅丹明B的常規(guī)拉曼光譜如圖5a中的d光譜所示，未見明顯的拉曼信號(hào)，而滴加了新制銀膠的羅丹明B拉曼信號(hào)較好，峰譜信息豐富，特征峰明顯，由此證明，本實(shí)驗(yàn)自制的銀膠具有良好的拉曼信號(hào)增敏作用。

為考察本實(shí)驗(yàn)自制銀膠增敏效果的靈敏度，分別配制質(zhì)量濃度為0.000 5，0.000 2，0.000 1，0.000 08、0.000 05和0.000 01 g/mL羅丹明B溶液，分別滴加等體積的新制銀膠后測試不同質(zhì)量濃度羅丹明B的SERS，如圖5b。結(jié)果顯示，濃度低至0.000 05 g/mL的羅丹明B在增敏材料的作用下亦可出現(xiàn)較理想的拉曼信號(hào)，當(dāng)濃度為0.000 01 g/mL時(shí)，即使在添加了增敏材料的情況下也未能觀察到有效的拉曼信號(hào)。由此可推測，在本實(shí)驗(yàn)中所制備銀溶膠的作用下，可檢測到質(zhì)量濃度為0.000 05 g/ mL的單一化學(xué)物質(zhì)。

2.2 三七的SERS圖譜及解析

2.2.1 三七樣品的拉曼光譜 三七粉末樣品的常規(guī)拉曼以及SERS測試圖譜如圖6，三七粉末樣品直接測試其常規(guī)拉曼光譜得到一個(gè)“熒光包”，并未獲得拉曼信號(hào)，這可能與中藥材成分復(fù)雜、熒光強(qiáng)等因素有關(guān)；滴加了新制銀溶膠的三七粉末樣品，測試了其樣品的多個(gè)位置，驗(yàn)證得出該圖譜穩(wěn)定，特征峰位置固定，該圖譜可用作鑒別20頭云三七藥材的佐證。

圖6 三七粉末樣品的常規(guī)拉曼光譜及表面增強(qiáng)拉曼光譜

三七水提/醇提樣品與等體積的新制銀膠混合后測試其SERS，結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明，三七水提液的常規(guī)拉曼光譜圖為一“熒光包”，而加了等體積的銀溶膠后，在310，475，615，740，925，943，1 080，1 120，1 330 cm-1處出現(xiàn)了微弱的拉曼信號(hào)。三七醇提液的常規(guī)拉曼光譜在1 030，1 465 cm-1出現(xiàn)了2個(gè)明顯的拉曼信號(hào)，而該兩處的拉曼信號(hào)峰正好與甲醇的2個(gè)特征峰位置一致，實(shí)為C-H的面內(nèi)振動(dòng)以及C-O-H的彎曲振動(dòng)引起的拉曼信號(hào)；滴加了等體積新制銀膠的三七醇提液樣品的SERS圖譜在735，943，1 030，1 080，1 330，1 385，1 465以及1 533 cm-1等處出現(xiàn)了微弱的拉曼信號(hào)，扣除溶劑峰后，735，943，1 080，1 330 cm-1等相同位置出現(xiàn)了拉曼信號(hào)，其中735，943，1 330 cm-1可能是三七中糖類碳水化合物的特征峰，而1 080 cm-1可能為人參皂苷分子母核六元環(huán)的C-C振動(dòng)峰，水提液中925，1 120 cm-1為人參皂苷中C-O-C醚鍵的振動(dòng)峰，310，475 cm-1等600 cm-1以下多為三七中有效成分的環(huán)骨架模型引起的振動(dòng)［19］。

圖7 三七提取液的常規(guī)拉曼光譜以及表面增強(qiáng)拉曼光譜

2.2.2 三七醇提液的TLC-SERS檢測 由以上測試結(jié)果可知，三七粉末樣品滴加了自制銀膠后會(huì)出現(xiàn)拉曼信號(hào)，但由于成分太復(fù)雜、熒光較強(qiáng)等干擾因素的存在，三七粉末的SERS圖譜的信息并不豐富，嚴(yán)格意義上講只存在個(gè)別特征峰；而三七水提液和醇提液與銀膠混合后測試的SERS圖譜有相應(yīng)拉曼信號(hào)出現(xiàn)，但是信號(hào)均較微弱，熒光影響依然存在。

為了進(jìn)一步克服中藥復(fù)雜系統(tǒng)拉曼熒光強(qiáng)的弱點(diǎn)，得到三七中單一有效成分的詳細(xì)拉曼圖譜，本實(shí)驗(yàn)采取了將經(jīng)過甲醇粗提的三七樣品經(jīng)TLC法進(jìn)行簡單分離后，測試其單一組分的SERS。為排除硅膠存在對(duì)測定主成分的影響，本實(shí)驗(yàn)中先測試硅膠G的SERS作為空白對(duì)照，結(jié)果如圖8所示，空白硅膠G的SERS并沒有明顯的拉曼信號(hào)，所以對(duì)樣品中主成分的拉曼光譜信號(hào)并無影響。

圖8 空白硅膠G的表面增強(qiáng)拉曼光譜

圖9為顯色斑點(diǎn)采集樣品A、B、C的SERS圖譜，結(jié)果顯示3種單一成分在471，543，960，1 015，1 113，1 233，1 374，1 475 cm-1附近均有拉曼峰出現(xiàn)，推測其為三七中人參皂苷母核及相同基團(tuán)振動(dòng)變形所引起的。如1 015 cm-1附近為伯醇C-C-O的面外伸縮振動(dòng)，1 113 cm-1為仲醇C-C-O的面外伸縮振動(dòng)，1 233 cm-1為環(huán)氧化合物的環(huán)對(duì)稱伸縮，1 374 cm-1為六元環(huán)的環(huán)伸縮，1 457 cm-1為六元環(huán)椅式異構(gòu)體的剪式振動(dòng)［20-21］。

但比較3個(gè)圖譜可發(fā)現(xiàn)，除了以上共有峰以外，每個(gè)成分的SERS還有其特征峰。如斑點(diǎn)A樣品的SERS圖譜中726，781 cm-1等特征峰，斑點(diǎn)B樣品的SERS圖譜中212，743，1 169 cm-1等特征峰，斑點(diǎn)C樣品的SERS圖譜中361 cm-1處出現(xiàn)的峰。根據(jù)這些特征峰的信息，我們可以用SERS來區(qū)分和鑒別三七提取物中不同的有效成分，建立三七中各種有效成分的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照拉曼圖譜，更便于實(shí)際鑒別操作中的成分鑒別，也為今后應(yīng)用SERS定量分析中藥材中有效成分打下基礎(chǔ)。

圖9 三七TLC分離斑點(diǎn)的表面增強(qiáng)拉曼光譜

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了利用SERS技術(shù)快速、穩(wěn)定、靈敏地分析測試三七藥材粉末、三七藥材提取物中成分的方法，以及經(jīng)簡單預(yù)處理后，結(jié)合TLC分離方法，應(yīng)用SERS來檢測分析三七中單一有效成分的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SERS法可快速獲得三七藥材粉末、三七提取物的特征拉曼光譜，在今后的實(shí)驗(yàn)中可借鑒此法建立不同產(chǎn)地以及不同采收季節(jié)等三七的拉曼圖譜庫，進(jìn)一步完善三七藥材拉曼光譜鑒定的方法。另外，可結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，采用TLCSERS法，建立三七提取物中多個(gè)不同成分的標(biāo)準(zhǔn)SERS庫，直接作為各有效成分的參考對(duì)照。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)中所建立的方法可拓展到其他中藥材的鑒定和分析中，為中藥快檢技術(shù)提供新的方法。

［1］ 黃冬蘭，陳小康，徐永群，等.三七炮制前后的紅外光譜分析研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2014，34（7）：1849-1852.

［2］ Ding R，Bao J，Wan J，et al.Panax notoginseng saponins protect against chronic ethanolinduced hepatic steatosis［J］.JChin Pharm Sci，2014，23（6）：361-368.

［3］ 孫曉東，李軍，韓立敏.薄層掃描法測定三七中皂甙元齊墩果酸的含量［J］.陜西中醫(yī)，2009，30（3）：346-347.

［4］ 王德民，孫大雨，王彥波，等.高效液相色譜法測定冠心丹參滴丸中三七皂苷R1的含量［J］.黑龍江醫(yī)藥，2014，27（2）：244-246.

［5］ 劉偉芬，李祿輝.三七皂甙類成分分析方法研究進(jìn)展［J］.中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2014，12（3）：162-163.

［6］ 文屏，王建文，蔡珊珊.UPLC法測定九味肝泰膠囊中人參皂苷Rg1及三七皂苷R1的含量［J］.中國當(dāng)代醫(yī)藥，2014，21（10）：9-15.

［7］ 楊美麗，戴忠，胡曉茹，等.UPLC法同時(shí)測定三七傷藥片中4個(gè)成分含量［J］.藥物分析雜志，2014，34（5）：924-927.

［8］ Zajac A，Hanuza J，Dymińska L.Raman spectroscopy in determination of horse meat content in the mixture with othermeats［J］.Food Chem，2014，156：333-338.

［9］ Haughey SA，Galvin-King P，Ho Y，etal.The feasibility of using near infrared and Raman spectroscopic techniques to detect fraudulent adulteration of chili powders with Sudan dye［J］.Food Control，2015，48：75-83.

［10］ ?zbalci B，Boyaci IH，Topcu A，et al.Rapid analysis of sugars in honey by processing Raman spectrum using chemometricmethods and artificial neural networks［J］.Food Chem，2013，136（3/4）：1444-1452.

［11］ Nakashima S，Ogura T，Kitagawa T.Infrared and Raman spectroscopic investigation of the reaction mechanism of cytochrome c oxidase［J］.Biochim Biophys Acta，2015，1847（1）：86-97.

［12］ Orelio CC，Beiboer SH，Morsink MC，et al.Comparison of Raman spectroscopy and twomolecular diagnostic

methods for Burkholderia cepacia complex species identification［J］.JMicrobiol Methods，2014，107：126-132.

［13］ Gao Q，Liu Y，Li H，et al.Comparison of several chemometric methods of libraries and classifiers for the analysis of expired drugs based on Raman spectra［J］.J Pharm Biomed Anal，2014，94：58-64.

［14］ Boiret M，Rutledge DN，Gorretta N，et al.Application of independent componentanalysis on Raman images of a pharmaceutical drug product：Pure spectra determination and spatial distribution of constituents［J］.JPharm Biomed Anal，2014，90：78-84.

［15］ McAughtrie S，F(xiàn)aulds K，Graham D.Surface enhanced Raman spectroscopy（SERS）：Potential applications for disease detection and treatment［J］.JPhotoch Photobio C，2014，21：40-53.

［16］ Shiohara A，Wang Y，Liz-Marzán LM.Recent approaches toward creation of hot spots for SERS detection［J］.JPhotoch Photobio C，2014，21：2-25.

［17］ Lee PC，Meisel D.Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes on silver and gold sols［J］.J Phys Chem，1982，86：3391-3395.

［18］ 尹利輝，張雁.正電性納米銀膠的表征及加入不同凝聚劑后的表面增強(qiáng)拉曼散射光譜［J］.藥物分析雜志，2010，30（12）：2352-2355.

［19］ 許以明.拉曼光譜及其在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：3-8.

［20］ 柯以侃，董慧茹.分析化學(xué)手冊(cè)：光譜分冊(cè)［M］.2版.北京：化學(xué)化工出版社，1998：1151-1161.

［21］ 多林希FR，佛特利WG，本特利FF.有機(jī)化合物的特征拉曼頻率［M］.朱自瑩，譯.北京：中國化學(xué)會(huì)出版社，1980：8-9.

Rapid analysis of active ingredients in Panax notoginseng using surface enhanced Raman spectroscopy

WEICheng-hua，CHEN Juan，XU Man-ling，QIXue-yong
（School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To establish surface-enhanced Raman spectroscopy（SERS）method for rapid analysis of active ingredients in Panax notoginseng.M ethods：Panax notoginseng was pretreated simply，then we tested the powder，water and alcohol extracts of Panax notoginseng by SERS respectively.We also got the spectrum of single active ingredient of the alcohol extracts combined with TLC，and analyzed these spectrum.Results：The powder，water and alcohol extracts of Panax notoginseng only could obtain weak signals of SERS directly，but the single active ingredient of Panax notoginseng separated by TLC technology could obtain its SERS spectra ideally.Conclusion：Themethod established in this article for rapid analysis of Panax notoginseng was efficient，rapid，specific，and high sensitivity，it can be extended to quality control and analysis in the identification of other herbalmedicines.

surface-enhanced Raman spectroscopy；Panax notoginseng；rapid analysis

R282.5 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A ［文章編號(hào)］ 1671-7783（2015）03-0263-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y150009

江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410299029Z）

衛(wèi)程華（1994—），女，本科生；戚雪勇（通訊作者），副教授，E-mail：qixyemail@163.com

2015-01-16 ［編輯］ 何承志