劉原，楊華，吳亮，蘇丹華，付濤，郭雪，劉曼，姜旭淦，陳盛霞，曹建平

（1.江蘇大學醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所，上海200025）

弓形蟲棒狀體蛋白16的原核表達及多克隆抗體制備

劉原1，楊華1，吳亮1，蘇丹華1，付濤1，郭雪1，劉曼1，姜旭淦1，陳盛霞1，曹建平2

（1.江蘇大學醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所，上海200025）

目的：克隆剛地弓形蟲RH株速殖子棒狀體蛋白（rhoptry protein，ROP）16基因，并構建ROP16基因的原核表達系統(tǒng)，檢測和定位ROP16蛋白的表達。方法：以弓形蟲RH株速殖子基因組DNA為模板，PCR擴增弓形蟲ROP16基因，克隆至pET-32a（+）載體，在大腸埃希菌Rosetta中誘導表達。經(jīng)KCl染色切膠法純化重組ROP16蛋白，并制備其兔多克隆抗體。采用蛋白質印跡法和間接免疫熒光法檢測和定位ROP16在弓形蟲速殖子內(nèi)的表達。結果：成功表達并純化重組ROP16蛋白，制備了其多克隆抗體。蛋白質印跡法檢測出相對分子質量為74 000的特異性條帶，間接免疫熒光實驗顯示ROP16分布于弓形蟲速殖子胞質內(nèi)。結論：經(jīng)原核表達重組ROP16制備的多克隆抗體能檢測和定位ROP16在弓形蟲速殖子內(nèi)的表達。

剛地弓形蟲；棒狀體蛋白16；原核表達；KCl染色切膠

剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是專性細胞內(nèi)寄生原蟲，幾乎可感染包括人類在內(nèi)的所有恒溫動物。弓形蟲感染會導致孕婦胎兒畸形、流產(chǎn)、早產(chǎn)甚至死胎。同時，作為一種機會致病寄生蟲，它也是引起艾滋病、惡性腫瘤和器官移植等免疫功能嚴重抑制或缺陷患者死亡的原因之一。弓形蟲分泌的棒狀體蛋白（rhoptry proteins，ROPs）在其入侵細胞過程中發(fā)揮了極其重要的作用。ROPs主要分布于納蟲泡膜、納蟲泡內(nèi)和宿主細胞內(nèi)（細胞核和細胞質）［1］，僅有ROP16和蛋白磷酸酯酶2C（PP2C-Hn）被發(fā)現(xiàn)可以入侵宿主細胞核。ROP16可通過影響細胞的信號轉導和轉錄激活因子（STAT）信號傳導途徑，干擾細胞的增殖、分化及凋亡等［2］。此外，ROP16屬于ROP2家族成員，是絲氨酸 蘇氨酸激酶，并具有蛋白激酶活性［3］，在弓形蟲逃避宿主免疫應答中起重要的作用［4］。國內(nèi)尚未見弓形蟲ROP16原核表達的相關報道。本研究通過對弓形蟲ROP16進行原核表達，制備其多克隆抗體，檢測并定位ROP16在弓形蟲速殖子中的表達，為深入研究ROP16的功能及闡明弓形蟲的致病機制提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲株、細胞株、菌株、載體和動物

剛地弓形蟲RH株速殖子由復旦大學醫(yī)學院病原生物學系徐大剛教授提供，液氮中長期保存。將我室長期保存在液氮中的人包皮成纖維（HFF）細胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中，用0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中。原核表達載體pET-32a（+）及大腸埃希菌（E.coil）DH5α株和Rosetta（DE3）株為本室保存。pTG19-T載體購自上海捷瑞生物工程有限公司。雄性新西蘭兔，約2.0 kg，購自江蘇大學動物實驗中心，清潔級環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ、Xho I和蛋白質分子質量標準品（立陶宛Fermentas公司）；質粒小量制備試劑盒（離心柱型）、GenClean瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（離心柱型）、2×PCR預混液、牛血清白蛋白購自上海捷瑞生物工程有限公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；DMEM培養(yǎng)液購自美國Thermo Fisher（中國）有限公司；FITC標記羊抗兔IgG（FITCIgG）、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG（HRP-IgG）和硝酸纖維素膜購自武漢博士德公司；弗氏完全佐劑和不完全佐劑（美國Sigma公司）；增強型ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。全自動凝膠成像儀及垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司），激光共聚焦顯微鏡（德國萊卡公司）。

1.3 DNA的提取

參照文獻［5］的方法體外培養(yǎng)弓形蟲速殖子于HFF細胞中，鏡下觀察到蟲體脹破80%～90%細胞，并可見蟲體游離于細胞外時，收集蟲體。按試劑盒操作說明提取弓形蟲速殖子基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 目的基因擴增

根據(jù)基因庫中顯示的弓形蟲RH株速殖子基因組ROP16的基因序列（登錄號GQ249080.1），利用DNAStar引物設計軟件設計引物。上游引物ROP16-F：5′-GGCGAATTCATGAAAGTGACCACGAAAGGGCTT-3′（下劃線為EcoRⅠ酶切部分），下游引物ROP16-R：5′-GGCCTCGAGCATCCGATGTGAAGAAAGTTCGGTAG-3′（下劃線為Xho I酶切部分），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以速殖子基因組DNA為模板，擴增弓形蟲ROP16編碼基因。PCR反應體系：PCRGreen Mix 25μL，上游引物和下游引物各2μL，模板DNA 4μL，滅菌蒸餾水17μL，總體積為50μL。反應條件：94℃10 s（熱啟動）；94℃5 s，56.8℃60 s，72℃2 min，共25個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用GenClean瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物并純化。

1.5 ROP16/pET32a表達載體的構建

將目的基因片段與載體pTG19-T連接，構建pTG19-T-ROP16載體。將pTG19-T-ROP16轉化DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)氨芐西林篩選、PCR擴增及BamHⅠ酶切鑒定，測序分析陽性克隆。將測序正確的陽性重組質粒以限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ酶切回收ROP16基因片段，通過T4連接酶與pET32a連接，構建pET32a-ROP16表達載體，轉化DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)過氨芐西林篩選及酶切鑒定陽性克隆。

1.6 重組ROP16在Rosetta菌中的誘導表達

將重組ROP16陽性克隆質粒導入Rosetta感受態(tài)菌中。取培養(yǎng)12 h的陽性克隆菌液200μL，按1∶100比例加入含氨芐西林的20 mL LB培養(yǎng)基中。當光密度值［D（600 nm）］達到0.6左右，將上述菌液加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG進行誘導表達，分別于2，4，6，8，10 h收集菌體，取5μL離心后樣本上清液進行SDS-PAGE分離，并根據(jù)電泳結果確定最佳誘導條件。

1.7 重組ROP16蛋白的純化

按最佳誘導條件誘導表達，收集菌體沉淀，加入PBS并重懸混勻，取冰上超聲裂解后上清液和沉淀進行SDS-PAGE電泳分離，電泳結果顯示目的蛋白在包涵體中。故在剩余菌體沉淀中，按每100 mL菌液加入4mL包涵體結合緩沖液，超聲裂解后取上清液，采用Ni-NTA親和純化柱純化蛋白，SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)無目的條帶，蛋白未能純化。故采用KCl染色切膠法純化目的蛋白［6］。大量表達重組蛋白ROP16，收集菌體沉淀并用包涵體洗滌緩沖液充分洗滌除去雜蛋白，經(jīng)包涵體結合緩沖液變性、超聲裂解等處理后得到上清液，SDS-PAGE電泳后，用1 mol/L預冷的KCl溶液染色5 min，對照考馬斯亮藍染色的蛋白標準分子質量，可見1條明顯的目的條帶。將目的蛋白條帶切下，置于EP管中，-70℃保存。

1.8 重組ROP16蛋白多克隆抗體制備

取出-70℃保存的膠條，每根膠條加1mL弗氏佐劑研磨至肉眼無可見顆粒為止，于背部皮下注射免疫新西蘭兔，首次免疫使用弗氏完全佐劑研磨，分別于初次免疫后第21天、28天和35天使用弗氏不完全佐劑研磨膠條并加強免疫新西蘭兔。于最后一次免疫前抽取兔耳緣靜脈血，當ELISA法檢測的血清抗體效價＞1∶51 200時，終止免疫，心臟采血，4 000 r/ min離心20 min，將血清保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.9 蛋白質印跡法檢測ROP16的表達

將弓形蟲RH株培養(yǎng)于生長狀態(tài)良好的HFF細胞中，鏡下觀察蟲體脹破80%～90%細胞，并可見蟲體游離于細胞外時，收集蟲體，以HFF細胞作為陰性對照。用10μL 1×SDS-PAGE上樣緩沖液將蟲體及細胞沉淀重懸，煮沸5 min，4℃、16 400 r/ min離心10 min。取上清液5μL加樣進行SDSPAGE電泳，將目的蛋白于150 mA、80 min條件下轉印到NC膜上，用5%脫脂奶粉封閉30 min，將制備的多克隆抗體（1∶200）作為一抗，室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌3次；將HRP標記的羊抗兔IgG（1∶5 000）作為二抗，室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗滌3次后加入ECL顯色，觀察結果。

1.10 間接免疫熒光法（IFA）檢測ROP16的分布

無菌條件下于6孔細胞培養(yǎng)板每孔中間放置1個蓋玻片，加入適量含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，2.5×105個/孔接種HFF細胞。細胞生長至90%左右時，1×106個/孔接種弓形蟲RH株，輕搖混勻后置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后移除培養(yǎng)液，加入2 mL 4%低聚甲醛室溫固定10 min，吸去低聚甲醛后加入2 mL 0.25%TritonX-100透化10 min，5%BSA室溫封閉2 h。滴加兔抗重組ROP16蛋白抗血清（1∶200）室溫孵育1 h，用PBS緩沖液洗滌3次；滴加FITC-IgG（1∶50）室溫孵育1 h，PBS緩沖液洗滌3次；取2μL DAPI至3 mL PBS緩沖液中，染色10 min后再用PBS緩沖液洗滌3次；封片后激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光在蟲體內(nèi)的分布。

2 結果

2.1 弓形蟲ROP16基因的PCR擴增

以弓形蟲基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增后進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，獲得2 121 bp片段（圖1），與弓形蟲ROP16理論長度相符。

圖1 PCR擴增弓形蟲ROP16基因

2.2 ROP16/pET32a重組質粒的鑒定

將ROP16/pET32a重組質粒進行Eco RⅠ和XhoⅠ雙酶切，得到大小約為5 422 bp和2 121 bp的兩條片段（圖2），與預期結果相符，說明ROP16被完整插入到pET32a（+）載體中。

圖2 ROP16/pET32a（+）重組質粒Eco RⅠ和XhoⅠ雙酶切結果

2.3 重組蛋白的鑒定與純化

誘導表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳，結果顯示在相對分子質量99 800處出現(xiàn)1條蛋白表達條帶（圖3），與重組質粒理論蛋白分子質量相符。將KCl染色切膠法純化獲得的膠條與PBS混合，研磨至沒有顆粒，取上清液進行SDS-PAGE電泳，可見純化的蛋白回收條帶（圖3）。

圖3 弓形蟲ROP16重組蛋白的表達與純化

2.4 弓形蟲ROP16蛋白的表達

蛋白質印跡檢測結果顯示，相對分子質量為74 000的條帶可被兔抗重組ROP16蛋白多克隆抗血清識別（圖4），與重組ROP16蛋白相對分子質量大小相符。由此可以證明KCl染色切膠純化法制備的兔抗多克隆抗體具有較高的免疫反應活性。

圖4 蛋白質印跡法檢測弓形蟲ROP16蛋白的表達

2.5 IFA檢測弓形蟲ROP16的表達

激光共聚焦顯微鏡下可見ROP16蛋白的綠色熒光分布于弓形蟲速殖子胞質內(nèi)，位于細胞核前端，與棒狀體位置相符（圖5）。

圖5 弓形蟲ROP16蛋白的分布（IFA×1 000）

3 討論

棒狀體是僅在頂復門寄生蟲中發(fā)現(xiàn)的一種專性分泌器官，其分泌的蛋白直接進入宿主細胞，發(fā)揮各自的功能。弓形蟲棒狀體分泌的蛋白改變宿主細胞的很多正常生理功能，從而感染大范圍的宿主物種和細胞種類［7］。目前已鑒定出9種棒狀體蛋白［8］，而唯一能入侵宿主細胞核的只有ROP16。不同弓形蟲蟲株間ROP16基因序列呈多態(tài)性［9］，ROP16因其特殊的功能和在宿主細胞內(nèi)的定位，成為宿主和弓形蟲之間相互作用的關鍵因子［10-11］。

本研究采用聚合酶鏈反應、黏性末端雙酶切、體外定向克隆、轉化感受態(tài)細胞、篩選鑒定、蛋白免疫印跡、間接免疫熒光等方法，對ROP16進行原核表達，成功制備了重組ROP16兔多克隆抗體，并檢測到ROP16在弓形蟲RH株速殖子中的表達和分布，為后續(xù)研究ROP16的生物學功能及其在弓形蟲致病中的作用提供了技術支持。

目的蛋白在大腸埃希菌中的表達形式分為兩種：一是非可溶性的包涵體顆粒，二是可溶性的蛋白質。本研究中ROP16/pET32a（+）重組蛋白以包涵體形式存在，未能用Ni-NTA親和純化法獲得目的蛋白，原因可能是擬表達的重組蛋白相對分子質量較大或空間結構較為復雜，其His標簽可能會被包裹在蛋白內(nèi)，無法與鎳柱結合，難以通過鎳螯合層析法純化［12］。于是我們采用染色切膠法獲取目的蛋白，該方法首先要選取一個合適的染料，不僅能將目的蛋白短時間內(nèi)顯現(xiàn)出來，而且還不能破壞其結構。通常采用的考馬斯亮藍R-250染色方法會使蛋白質的一級結構受到影響［13］，于在江等［14］用NaAc染色切膠的方法成功純化了目的蛋白，但因電泳、染色等過程耗時較長，使用受到限制。與NaAc染色切膠法相比，KCl染色切膠法具有如下優(yōu)點：①更加高效，獲取的目的蛋白可反復凍融，且不會導致濃度和純度的改變；②試劑成本低，性價比高［15］。

本研究采用IFA技術，以重組ROP16蛋白制備的多抗，在弓形蟲速殖子入侵的宿主細胞核內(nèi)未能檢測出ROP16的分布，與已有的研究報道不一致［11，16］，可能是制備的多抗特異性沒有單抗強。下一步我們將構建帶有Myc標簽的ROP16突變株，用Myc單抗來檢測ROP16蛋白在宿主細胞核內(nèi)的分布。

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Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of rhoptry protein 16 from Toxoplasma gondii

LIU Yuan1，YANG Hua1，WU Liang1，SU Dan-hua1，F(xiàn)U Tao1，GUO Xue1，LIU Man1，JIANG Xu-gan1，CHEN Sheng-xia1，CAO Jian-pin2
（1.School ofMedicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.National Institute of Parasitic Diseases，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Shanghai200025，China）

Objective：To clone and construct a recombinant expression plasmid of rhoptry protein（ROP）16 from tachyzoites of Toxoplasma gondii（T.gondii）RH strain in Escherichia coli，and to determine and locate the expression of ROP 16 in tachyzoites.M ethods：The ROP16 gene was amplified from genomic DNA of T.gondii RH strain and cloned into the plasmid pET-32a（+）.The expression of the recombinant pET32a-ROP16 was induced in E.coli Rosetta strain，and ROP16 was purified by cutting the gel sliceswith KCl stain.The anti-ROP16 polyclonal antibody was produced in rabbit，and ROP16 in tachyzoiteswas analyzed by Western blotting and indirect immunofluorescence assay（IFA）respectively.Results：The recombinant plasmid pET32a-ROP16 was successfully expressed and purified，and the anti-ROP16 polyclonal antibody was obtained.The 74 000 specific band of ROP16 was detected by Western blotting，and the ROP16 was distributed in the cytoplasm of tachyzoites by IFA.Conclusion：The anti-ROP16 polyclonal antibody prepared by recombinant ROP16 can detectand locate the expression of ROP16 in tachyzoites of T.gondii.

Toxoplasma gondii；ROP16；prokaryotic expression；KCl stain

R382.5 ［文獻標志碼］ A ［文章編號］ 1671-7783（2015）03-0251-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y140296

國家自然科學基金資助項目（81301453）；衛(wèi)生部寄生蟲病原與媒介生物學重點實驗室開放課題（WSBKTKT201302）；中國博士后科學基金資助項目（2014M561598）；江蘇省博士后科研資助計劃項目（1402171C）；江蘇大學高級人才啟動基金資助項目（13JDG023，13JDG127）

劉原（1991—），女，碩士研究生；陳盛霞（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail：chensxia@ujs.edu.cn

2014-11-15 ［編輯］陳海林