李逸峰，徐宏光，王 弘

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院 骨科，安徽 蕪湖 241001)

椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IVDD)是脊柱退行性疾病發(fā)生發(fā)展的始動因素和病理基礎(chǔ)，營養(yǎng)供應(yīng)的減少是椎間盤退變的關(guān)鍵因素。終板軟骨作為椎間盤的主要營養(yǎng)途徑，對髓核的營養(yǎng)供應(yīng)和形態(tài)維持具有重要的作用，終板軟骨的生物學(xué)活性及表型維持與椎間盤退變密切相關(guān)。

終板軟骨屬于透明軟骨，由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組成，蛋白多糖(PG)是軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)構(gòu)建的協(xié)調(diào)者。軟骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)過程中，隨著形態(tài)的改變，伴隨有表型的丟失及代謝的變化，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)具有調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分化和促進(jìn)胞外基質(zhì)合成的作用［1－2］，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)作為TGF-β的超基因家族成員之一，也可促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成PG［3］，但對軟骨細(xì)胞的增殖作用與TGF-β不盡相同。雖然終板軟骨與關(guān)節(jié)軟骨同屬透明軟骨，然而二者又都具有各自不同的特點(diǎn)，而TGF-β1與BMP-2對于終板軟骨細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的合成是否有影響尚無定論，本實(shí)驗(yàn)就TGF-β1、BMP-2聯(lián)合應(yīng)用對體外培養(yǎng)大鼠終板軟骨細(xì)胞增殖和合成糖胺多糖的影響作初步研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取3～4周齡清潔級SD大鼠30只，體質(zhì)量160～180 g，由南京青龍山動物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶均購自上海生工公司，重組人 TGF-β1、重組人 BMP-2均購自美國ReproTech公司，Cel1Titer96 AQueous單溶液增殖反應(yīng)試劑分析盒為美國Promega公司產(chǎn)品，Nano-Drop 2000美國Thermo＆Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠終板軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)與分組 取10只SD大鼠，頸椎脫臼處死后75%酒精浸泡15 min，置于超凈臺內(nèi)取出整個(gè)腰椎，剝離腰1至腰5椎間盤的終板軟骨。酶消化法分離終板軟骨細(xì)胞，分離和培養(yǎng)具體方法參考相關(guān)文獻(xiàn)［4］。終板軟骨細(xì)胞單層融合80% ～90%時(shí)傳代:吸盡培養(yǎng)液，PBS清洗，0.25%胰蛋白酶消化2 min，含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，1000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，均勻種植于培養(yǎng)皿中。選取第2代軟骨細(xì)胞。將收集的軟骨細(xì)胞分別接種入96孔板，每孔為2×103細(xì)胞，各孔加入0.1 mL的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清DMEM/F12。根據(jù)培養(yǎng)液中含生長因子的不同分4組，A組:培養(yǎng)液中無生長因子(對照組);B組:培養(yǎng)液中加入 TGF-β1(10 ng/mL)(實(shí)驗(yàn)組);C組:培養(yǎng)液中加入BMP-2(10 ng/mL)(實(shí)驗(yàn)組);D組:培養(yǎng)液中加入TGF-β1(10 ng/mL)和BMP-2(10 ng/mL)(實(shí)驗(yàn)組)。每組4×10孔，置5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3天常規(guī)換液一次，每天在倒置相差顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞的生長情況及形態(tài)變化，連續(xù)培養(yǎng)16 d。

1.3.2 細(xì)胞增殖的測定及GAG定量 細(xì)胞增殖測定:以CellTiter 96～AQueous單溶液細(xì)胞增殖反應(yīng)試劑分析盒測定增殖活性，在細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)加入少量分析試劑并培養(yǎng)4 h，通過測定酶標(biāo)儀在492 nm波長測定OD值來確定活細(xì)胞的數(shù)量，同一條件的四孔數(shù)值平均后作為最終數(shù)據(jù)。阿辛藍(lán)染色及GAG定量:吸除培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，以4%多聚甲醛固定30 min后，自來水洗滌15 min，阿辛藍(lán)染色4 h，自來水洗滌，自然晾干后，Odyssey紅外掃描儀掃描成像，應(yīng)用Image J軟件對掃描圖像進(jìn)行半定量分析，輸出數(shù)據(jù)為GAG相對定量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0進(jìn)行分析，以±s表示，組間比較采用方差分析及t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性檢測。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞生長及形態(tài)觀察 對照組A組細(xì)胞培養(yǎng)12 h就可見細(xì)胞貼壁，2 d后貼壁細(xì)胞增多，培養(yǎng)早期多為多角形、短柱狀。實(shí)驗(yàn)組B組細(xì)胞12 h就可見少量細(xì)胞貼壁，多為多角形、短柱狀、細(xì)胞量少。C、D組細(xì)胞貼壁后呈多角形、短柱狀少數(shù)呈梭形，偶有多角形和扁平狀的小的集落，C、D組生長現(xiàn)象明顯，部分形成集落生長(圖1)。生長1 d，A組正常生長，B、C、D組多數(shù)孔細(xì)胞融合形成單層，后可見到細(xì)胞逐漸變?yōu)槎嘟切位蚨噙呅?，體積增大，胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多，細(xì)胞核間隙增大(圖2)。生長3 d，A組呈稀疏的長梭形，B、C、D組呈稠密的短梭形(圖3)，B組生長現(xiàn)象明顯，且活性維持好。B組早期生長緩慢，中后期生長迅速，C、D組生長迅速，以增長期更為明顯。生長7 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)多于對照組，并且不再以集落生長，而是均勻分布呈短梭形，D組誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)，成不規(guī)則形，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞之間排列緊密(圖4)。在常規(guī)培養(yǎng)條件下，生長后期10 d，軟骨細(xì)胞趨于成纖維細(xì)胞樣表型，在TGF-β1及BMP-2作用下，D組軟骨細(xì)胞多維持多角形或短梭性的正常形態(tài)表型，生長過程中的細(xì)胞集落和多層生長現(xiàn)象明顯，且活性維持好，好于A組(圖5)。

圖1 體外培養(yǎng)終板軟骨細(xì)胞1 d(×200)

2.2 細(xì)胞增殖測定 TGF-β1組單獨(dú)作用早期(1～3 d)呈現(xiàn)輕度的增殖抑制，其中在2 d的抑制作用最明顯，之后轉(zhuǎn)為增殖，6～7 d到達(dá)高峰。且由數(shù)值看，6、7 d TGF-β1 組的均值分別為 0.921 和0.905，高于對照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明TGF-β1相對低濃度和換液的條件下對體外單層培養(yǎng)軟骨細(xì)胞增殖表現(xiàn)為先抑制，后促進(jìn)的作用。

圖2 體外培養(yǎng)終板軟骨細(xì)胞3 d(×200)

BMP-2組均表現(xiàn)為輕度的、顯著的增殖促進(jìn)效應(yīng)，峰值同樣出現(xiàn)在6～7 d。且由數(shù)值看，6、7 d BMP-2組的均值分別為0.821和0.845，高于對照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

聯(lián)合應(yīng)用組在6、7 d的均值分別達(dá)到0.965和1.011，高于單一最佳效應(yīng)的 TGF-β1 組(P ＜0.01)及BMP-2組(P＜0.01)，說明聯(lián)合作用促增殖作用最強(qiáng)。從時(shí)間上看，聯(lián)合作用組在實(shí)驗(yàn)早期沒有出現(xiàn)增殖抑制，峰值同樣出現(xiàn)在6～7 d(表1)。

2.3 軟骨細(xì)胞GAG含量測定 與對照組相比，含生長因子的實(shí)驗(yàn)組均能明顯促進(jìn)體外培養(yǎng)的傳代軟骨細(xì)胞合成 GAG(表 2)。差異有顯著性(P＜0.05)。聯(lián)合應(yīng)用TGF-β1及BMP-2組合成糖胺多糖的作用最強(qiáng)，差異更加明顯(P＜0.01)。說明一定濃度的TGF-β1及BMP-2聯(lián)合應(yīng)用時(shí)在促進(jìn)細(xì)胞增殖的前提下，能顯著增加體外培養(yǎng)的第二代軟骨細(xì)胞GAG的合成量。

圖3 體外培養(yǎng)終板軟骨細(xì)胞5 d(×200)

圖4 體外培養(yǎng)終板軟骨細(xì)胞7 d(×200)

圖5 體外培養(yǎng)終板軟骨細(xì)胞10 d(×100)

表1 TGF-β1及BMP-2對體外培養(yǎng)大鼠終板軟骨細(xì)胞增殖的影響(±s，n=12)

表1 TGF-β1及BMP-2對體外培養(yǎng)大鼠終板軟骨細(xì)胞增殖的影響(±s，n=12)

與 A 組比較，＊＊P ＜0.01;與 B 組比較，△P ＜0.01;與 C組比較，#P ＜0.01

時(shí)間(d) A組 B組 C組 D組 F值 P值1±0.013 6.61 ＜0.05 2 0.302 ±0.032 0.301 ±0.026 0.328 ±0.012 0.336 ±0.021 6.74 ＜0.05 3 0.401 ±0.021 0.385 ±0.021 0.483 ±0.021 0.550 ±0.009 200.91 ＜0.01 4 0.485 ±0.201 0.501 ±0.035 0.523 ±0.035 0.562 ±0.026 1.23 ＞0.05 5 0.621 ±0.018 0.721 ±0.019 0.672 ±0.015 0.782 ±0.031 121.33 ＜0.01 6 0.712 ±0.026 0.921 ±0.004＊＊ 0.821 ±0.019＊＊ 0.965 ±0.011＊＊△# 518.72 ＜0.01 7 0.735 ±0.025 0.905 ±0.017＊＊ 0.845 ±0.013＊＊ 1.011 ±0.014＊＊△# 499.12 ＜0.01 0.295 ±0.012 0.290 ±0.016 0.305 ±0.006 0.310 8 2 ±0.024 79.41 ＜0.01 0.721 ±0.014 0.842 ±0.09 0.801 ±0.036 0.921 ±0.018 33.63 ＜0.01 9 0.705 ±0.031 0.846 ±0.031 0.782 ±0.006 0.901 ±0.019 147.51 ＜0.01 10 0.706 ±0.024 0.812 ±0.023 0.742 ±0.031 0.85

3 討論

細(xì)胞外基質(zhì)是細(xì)胞附著的基本框架和代謝場所，是維持細(xì)胞正常生存、分化和運(yùn)動的外環(huán)境，蛋白多糖類是軟骨的主要細(xì)胞外基質(zhì)，是關(guān)節(jié)軟骨的主要成分之一。研究表明關(guān)節(jié)軟骨中存在著許多生長因子，它們通過自分泌或旁分泌兩種基本方式來調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞，同時(shí)軟骨細(xì)胞也能合成許多生長因子和表達(dá)相應(yīng)的受體，從而調(diào)控軟骨組織、維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及創(chuàng)傷修復(fù)等病理生理過程。

表2 TGF-β1及BMP-2對體外培養(yǎng)大鼠終板軟骨細(xì)胞合成GAG含量的影響(±s，n=12)

表2 TGF-β1及BMP-2對體外培養(yǎng)大鼠終板軟骨細(xì)胞合成GAG含量的影響(±s，n=12)

注:與 A 組相比，*P ＜0.05，#P ＜0.01

組別GAG含量(μg/L)1 d 3 d 5 d 7 d 9 d 11 d 13 d A 140±15 220±26 260±20 300±16 330±18 280±30240±20 B 160±20 240±26 280±12 320±20* 350±10* 300±22* 260±16 C＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 170±10 220±18 260±18 316±26* 345±16* 300±12* 270±16 D 210±22 260±22 320±24 360±30# 420±12# 360±22# 330±16 F 值 34.41 8.148 26.59 13.99 93.57 28.63 61.64 P值

TGF-β1是一類具有多功能的多肽，在軟骨細(xì)胞的增殖、死亡、遷移和分化中起著非常關(guān)鍵的作用［5］。TGF-β1 能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、細(xì)胞外基質(zhì)合成和分泌。TGF-β1在不同的條件下對成軟骨細(xì)胞有促進(jìn)分化或降低分化的雙重作用，在軟骨細(xì)胞未分化或分化早期，促進(jìn)細(xì)胞合成、增殖、分化和基質(zhì)的合成，但隨著培養(yǎng)代數(shù)增加，促進(jìn)作用減小，且細(xì)胞增殖能力大大減弱。研究表明它在軟骨細(xì)胞發(fā)育的不同階段起的作用并不相同。TGF-β1對傳代軟骨細(xì)胞的基質(zhì)合成作用可能與細(xì)胞外基質(zhì)成分變化有關(guān)［6］，研究也表明TGF-β不僅能促進(jìn)體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞增殖，且也增加了PG合成，而且TGF-β在增加細(xì)胞合成蛋白多糖的同時(shí)，還改變了PG的糖基模式，使硫酸軟骨素鏈加長，磷酸化程度更高。在對TGF-β信號傳導(dǎo)的研究中，Hoover LL發(fā)現(xiàn)TGF-β信號通路與其他信號傳導(dǎo)通路存在交叉點(diǎn)［7］。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2是TGF-β的超家族成員之一，對關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)具有促進(jìn)作用［8］，有促進(jìn)軟骨分化、基質(zhì)形成，并抑制軟骨細(xì)胞去分化等作用，能誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞不可逆地分化為軟骨細(xì)胞［9］。BMP-2對原代軟骨細(xì)胞增殖作用不明顯，而促進(jìn)其向成熟方向分化明顯，大量研究證實(shí)，BMP-2信號通路參與成骨細(xì)胞分化和骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)合成與分泌，促進(jìn)骨形成，增加骨量［10］。

由于軟骨細(xì)胞具有高分化特性，所以普通單層貼壁培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞表型難以維持，軟骨細(xì)胞將會發(fā)生一系列的變化，包括形態(tài)、表型及相關(guān)基因的表達(dá)變化等去分化現(xiàn)象。軟骨細(xì)胞貼壁后在倒置顯微鏡下細(xì)胞多呈多角形、星形，胞質(zhì)顏色較深，胞核為圓形，細(xì)胞飽滿而大。單純從細(xì)胞的形態(tài)特征看，軟骨細(xì)胞梭形變是判斷軟骨細(xì)胞表型是否改變的直觀指標(biāo)。

我們的結(jié)果表明TGF-β1與BMP-2聯(lián)合使用，能更加明顯地促進(jìn)體外培養(yǎng)的終板軟骨細(xì)胞增殖，提高合成GAG基質(zhì)的能力，有利于終板軟骨細(xì)胞表型的維持，為終板軟骨細(xì)胞的進(jìn)一步研究提供了新的思路。在生長因子調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的生物學(xué)行為的作用中，相關(guān)生長因子間的相互作用以及受體-信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的變化仍然有待深入研究。

［1］Park MS，Kim YH，Lee JW，et al.FAK mediates signal crosstalk between type II collagen and TGF-beta 1 cascades in chondrocytic cells［J］.Matrix Biol，2010，29(2):135 － 142.

［2］Orlandi A，Oliva F，Taurisano G，et al.Transglutaminase-2 differently regulates cartilage destruction and osteophyte formation in a surgical model of osteoarthritis［J］.Amino Acids，2009，36(4):755－763.

［3］倪濱，李明.BMP生物活性的研究現(xiàn)狀［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2007，36(10):970－973.

［4］徐宏光，賴畢華，陳學(xué)武，等.Sox9基因在終板軟骨細(xì)胞退變模型中的表達(dá)變化及意義［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2008，88(37):2609－2613.

［5］Bhaskaran N，Souchelnytskyi S.Systemic analysis of TGFbeta proteomics revealed involvement of Plag1/CNK1/RASSF1A/Src network in TGFbeta1-dependent activation of Erk1/2 and cell proliferation［J］.Proteomics，2008，8(21):4507 －4520.

［6］Ab-Rahim S，Selvaratnam L，Kamarul T.The effect of TGF-beta1 and beta-estradiol on glycosaminoglycan and type II collagen distribution in articular chondrocyte cultures［J］.Cell Biol Int，2008，32(7):841－847.

［7］Hoover LL，Kubalak SW.Holding their own:the noncanonical roles of Smad proteins［J］.Sci Signal，2008，1(46):pe48.

［8］賀繼平，蘇曉云.轉(zhuǎn)化生長因子β_1與骨形態(tài)發(fā)生蛋白2對關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的價(jià)值［J］.中國組織工程研究與臨床，2009，13(46):9155－9158.

［9］Chen Y，Whetstone HC，Youn A，et al.Beta-catenin signaling pathway is crucial for bone morphogenetic protein 2 to induce new bone formation［J］.J Biol Chem，2007，282(1):526 －533.

［10］王霖霞，李玉坤.BMP-2信號通路與成骨細(xì)胞分化［J］.國際骨科學(xué)雜志，2009，30(2):132 －136.