劉 磊，常保超，陳 崢，吳雪平，楊麗娟

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科，安徽 蚌埠 233004;2.蚌埠醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233030)

腎小球濾過膜是維持腎臟濾過功能的重要結(jié)構(gòu)，其中，由足細(xì)胞的足突及其裂隙膜構(gòu)成的最外層的結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜，功能也最為重要，Nephrin是裂孔膜“拉鏈”結(jié)構(gòu)的主要成分，也是腎小球濾過膜存在分子選擇性的基礎(chǔ)［1－2］。近年來，有許多研究發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞及相關(guān)蛋白Nephrin表達(dá)異常是糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)蛋白尿發(fā)生的重要機(jī)制。霉酚酸酯(mycophenolate mofeti，MMF)能強(qiáng)有力地抑制T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖，目前作為免疫抑制劑在臨床上使用，新近有研究表明MMF干預(yù)治療糖尿病腎病大鼠，治療后大鼠高尿蛋白、腎小球高濾過、腎小球硬化及巨噬細(xì)胞浸潤程度均有所好轉(zhuǎn)［3］。本研究探討MMF是否通過調(diào)節(jié)Nephrin表達(dá)減少糖尿病腎病大鼠尿蛋白及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性SD大鼠30只(購自蚌埠醫(yī)學(xué)院動物中心)，隨機(jī)分為正常對照(NC)組(10只)、DN組(10只)、MMF組(10只)。用鏈脲佐菌素制作糖尿病腎病大鼠模型，DN、MMF組腹腔注射60 mg/kg STZ(以pH 4.2的0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液配制)，NC組注射同濃度的枸櫞酸緩沖液作為對照，腹腔注射STZ 3 d后進(jìn)行空腹血糖的測量，連續(xù)測量3 d，血糖＞16.7 mmol/L定為糖尿病腎病大鼠模型;造模成功后，MMF組給予MMF 15 mg/(kg·d)灌胃［4］，NC組、DN 組給予同等量的生理鹽水灌胃，早晚各灌1次。所有大鼠按分組分籠，按清潔級動物飼養(yǎng)，飼養(yǎng)周期為8周。

1.1.2 藥物 鏈脲菌素(STZ，美國 Sigma);MMF(杭州中美華東);枸櫞酸、2%戊巴比妥鈉、10%中性甲醛液(上?；瘜W(xué)試劑廠)，鏈酶菌抗生物素-過氧化物酶溶液(福州東旗);羊抗大鼠多克隆抗體Nephrin、兔抗大鼠單克隆抗體 MCP-1(武漢博士德)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集 各組大鼠飼養(yǎng)8周后分別置于代謝籠中收集24 h尿液，檢測尿蛋白定量;處死動物，收集血標(biāo)本檢測血糖、腎功能，測量腎質(zhì)量/體質(zhì)量;留取腎標(biāo)本分別進(jìn)行病理、免疫組化及逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測。

1.2.2 病理學(xué)檢查 部分腎組織經(jīng)10%甲醛固定，制成4 μm厚切片，行HE染色觀察腎小球病變;部分腎皮質(zhì)經(jīng)固定，切片50 μm，行電鏡觀察。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢查 采用SABC技術(shù)，將石蠟固定標(biāo)本制成4 μm厚切片，經(jīng)脫蠟及抗原修復(fù)后，切片分別與羊抗大鼠多克隆抗體 nephrin(1∶200)、兔抗大鼠單克隆抗體 MCP-1(1∶200)4℃孵育過夜。緩沖液沖洗后，滴加山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育2O～30 min。再次緩沖液沖洗3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。以HPLAS-400圖像分析系統(tǒng)對腎組織免疫組化結(jié)果行半定量分析，每張標(biāo)本按順序選5個腎小球，對所選視野內(nèi)的免疫組化陽性信號進(jìn)行圖像分析，以陽性目標(biāo)總面積占統(tǒng)計場總面積的百分比表示。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測 用TRIzol一步法提取組織總RNA，于260 nm和280 nm處測定其OD值，計算OD260/OD280比值，觀察純度。取總RNA 3 μL為模板，用隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Nephrin(94bp)正義序列5'-CCCGGACACCTGCATGATG-3'，反義序列 5'-GCTGCCACCTGGTCGTAGATT-3'。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性3 min后，以①95℃ 50 s變性;②退火溫度62℃ 30 s;③72℃ 60 s，反應(yīng)30個循環(huán)，最后一輪延長時間至10 min。MCP-1(146 bp)正義序列5'-CAGCCGACTCATTGGGATCA-3'，反 義 序 列 5'-CTATGCAGGTCTCTGTCACGCTTC-3'。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性3 min后，以①95℃ 50 s變性;②退火溫度58℃ 30 s;③72℃60 s，反應(yīng)30個循環(huán)，最后一輪延長時間至10 min。取PCR產(chǎn)物5 μL在15%的瓊脂糖凝膠電泳，然后在凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)上掃描，測定各目的基因吸光度值，分別計算其比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間采用F檢驗，兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般指標(biāo) 結(jié)果顯示，DN組和MMF組大鼠出現(xiàn)消瘦，毛發(fā)萎黃，體質(zhì)量較NC組明顯下降，而MMF組較DN組大鼠體質(zhì)量偏高;DN組和MMF組大鼠腎質(zhì)量/體質(zhì)量較NC組升高，且差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);DN組和MMF組大鼠24 h尿蛋白定量、BUN、Scr和FBS較NC組升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。具體情況見表1。

2.2 病理學(xué)改變 光鏡下經(jīng)PAS染色可見DN組及MMF組大鼠腎小球體積增大，基底膜增厚，腎小球毛細(xì)血管腔受壓變窄，NC組無明顯變化，而其中MMF組較NC組變化較輕，有一定程度的改善。電鏡結(jié)果顯示，DN組大鼠腎小球足突融合變平，可見部分基底膜裸露，部分足細(xì)胞脫落，MMF組大鼠較DN組足突融合減輕，足細(xì)胞脫落減少，而NC組無變化。見圖1。

表1 3組大鼠尿蛋白定量、血糖、血肌酐、尿素氮、腎質(zhì)量/體質(zhì)量(±s)

表1 3組大鼠尿蛋白定量、血糖、血肌酐、尿素氮、腎質(zhì)量/體質(zhì)量(±s)

注:與 NC 組相比*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，與 DN 組相比△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別 n 尿蛋白定量(g) Scr(μmol/L) BUN(mmol/L) FBS(mmol/L) KW/BW(×10－3)NC 10 4.85 ±1.02 32.00 ±5.33 6.69 ±1.78 6.10 ±1.0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 23 2.80 ±0.34 DN 10 44.72 ±6.00＊＊ 71.80 ±5.86＊＊ 34.41 ±4.98＊＊ 27.41 ±4.44＊＊ 5.00 ±1.01＊＊MMF 10 24.37 ±5.12＊＊△△ 39.60 ±6.48＊＊△△ 16.74 ±3.92＊＊△△ 24.65 ±5.13＊＊ 3.54 ±0.64＊△△F 188.478 127.872 136.336 84.747 24.329 P

圖1 光鏡下及電鏡下3組大鼠腎臟組織病理變化

2.3 免疫組化改變 NC組可見Nephrin蛋白均勻分布于腎小球基底膜，DN組Nephrin蛋白表達(dá)減少，呈顆粒狀不均勻分布，MMF組Nephrin表達(dá)較DN組改善，呈不均勻分布，部分可見顆粒樣中斷。DN組MCP-1蛋白表達(dá)增加，MMF組MCP-1蛋白表達(dá)減少，兩組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見圖2和表2。

圖2 經(jīng)免疫組化處理后3組大鼠腎臟組織中Nephrin、MCP-1的表達(dá)

表2 各組大鼠腎組織中Nephrin、MCP-1的表達(dá)(%)

2.4 RT-PCR檢測Nephrin及MCP-1mRNA表達(dá)變化 與NC組大鼠相比，DN組大鼠腎組織MCP-1mRNA表達(dá)顯著升高，Nephrin mRNA表達(dá)明顯下降(P＜0.01);經(jīng)MMF干預(yù)治療后，MMF組大鼠MCP-1mRNA表達(dá)減少，Nephrin mRNA表達(dá)增加(P＜0.05)。見圖 3。

圖3 RT-PCR檢測Nephrin及MCP-1mRNA表達(dá)變化

3 討論

近年來，糖尿病(diabetes mellitus，DM)的發(fā)病率迅速增加，對人類健康造成重大危害。DN是DM最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥，其發(fā)病率逐年上升，已成為終末期腎臟病的主要病因之一。DN的特征是大量蛋白尿，有研究揭示DN的發(fā)病與腎臟足細(xì)胞病變密切相關(guān)［5］。糖尿病伴微量白蛋白尿患者的腎臟足細(xì)胞特異蛋白Nephrin、α3β1整合素表達(dá)顯著下降，并與蛋白尿程度呈負(fù)相關(guān)［6－7］。DN后期足細(xì)胞脫落、凋亡增加和缺乏再生能力等導(dǎo)致足細(xì)胞的密度和數(shù)量減少;足細(xì)胞單層結(jié)構(gòu)破壞影響裂孔膜的完整性以及細(xì)胞間的連接和細(xì)胞糖萼蛋白丟失，使白蛋白和其他分子濾過增加，導(dǎo)致DN蛋白尿的發(fā)生［8－9］。單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是公認(rèn)的炎癥指標(biāo)。Han等［10］報道MCP-1由腎小球足細(xì)胞合成，并在腎小管間質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，MCP-1屬于CC趨化因子家族，可誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞浸潤腎小球、腎間質(zhì)細(xì)胞中，促進(jìn)基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)增生，加速腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，加快DN進(jìn)展［11］。霉酚酸酯(MMF)治療后糖尿病腎病大鼠腎組織MCP-1表達(dá)明顯降低，萎縮腎小管及間質(zhì)纖維化明顯減少，并可減輕蛋白尿;不論從基因水平還是從蛋白水平，MMF均可抑制MCP-1的表達(dá)抑制巨噬細(xì)胞的特異性趨化和增殖，減輕炎癥反應(yīng)，延緩DN的進(jìn)展。糖尿病模型中MCP-1在腎小球中高表達(dá)，MCP-1的缺失可減輕蛋白尿及上調(diào)Nephrin蛋白的表達(dá)［12］。Nephrin在維持裂孔膜復(fù)合體結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)揮重要作用，是腎小球濾過膜屏障的重要組成部分。蛋白尿的產(chǎn)生與Nephrin表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)［13］。本研究結(jié)果顯示，DN組大鼠24 h尿蛋白、腎質(zhì)量指數(shù)、Scr、BUN、FBS較NC組出現(xiàn)明顯異常，病理下腎組織損害明顯，MCP-1 mRNA表達(dá)明顯增加，Nephrin蛋白在腎小球基底膜表達(dá)下降，與相關(guān)研究相符。

MMF是霉酚酸(mycophenolic acid，MPA)的酯類衍生物，脫脂后形成具有免疫抑制活性的代謝產(chǎn)物MPA，從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。MMF主要通過抑制淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的增殖、減少抗體產(chǎn)生和細(xì)胞表面粘附分子的抑制，達(dá)到抗炎效果［14］。2003年Utimura等［15］首次在糖尿病模型中給予免疫抑制劑MMF干預(yù)，發(fā)現(xiàn)可明顯減輕腎小球硬化與尿白蛋白排泄率增加，其機(jī)制主要為抑制腎內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤。國內(nèi)外眾多的實驗證明，MMF可減少單核巨噬細(xì)胞浸潤、腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化及膠原沉積，延緩了RIF的進(jìn)展［16］。新近有研究發(fā)現(xiàn)MMF干預(yù)治療DN大鼠，大鼠尿白蛋白排泄和肌酐清除率顯著下降、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞浸潤減少、腎組織的ECM增生減輕，起到了有效的保腎作用［17］。本研究結(jié)果顯示，糖尿病腎病大鼠給予MMF組干預(yù)治療后，大鼠一般情況改善。在給藥第8周后體質(zhì)量較DN組明顯增高;24 h尿蛋白、腎質(zhì)量指數(shù)、Scr、BUN、FBS較DN組明顯降低;腎組織病理檢查損害明顯減低。MCP-1mRNA在腎組織中的表達(dá)明顯減少，Nephrin蛋白在腎小球基底膜表達(dá)明顯增加。

綜上所述，通過研究實驗動物腎組織中MCP-1及Nephrin表達(dá)，揭示了炎癥反應(yīng)對糖尿病腎病發(fā)病及病情發(fā)展起了重要作用，MMF可通過抑制炎癥反應(yīng)來調(diào)節(jié)Nephrin的表達(dá)，從而保護(hù)腎臟足細(xì)胞，改善病情，為臨床上治療糖尿病腎病提供了新的方向。

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