周萍萍，尹 康，吳露依，黃丹丹，靳文杰，馬智達(dá)，姜玉新

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.生理學(xué)教研室;2.臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是以持續(xù)氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑為主要特征的慢性呼吸道疾病，癥狀主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作性喘息、胸悶、咳嗽，其發(fā)病率高達(dá)29.1% ～32.2%［1］。哮喘發(fā)病受遺傳及環(huán)境雙重因素影響，發(fā)病機(jī)制主要是CD4+T細(xì)胞亞群Th1/Th2失衡，特別是偏向于Th2分化所致，其他CD4+T細(xì)胞亞群Th17及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)也參與了該病發(fā)生［3］。其病理特征為氣道嗜酸粒細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等長期浸潤，異常的Th2細(xì)胞應(yīng)答及其所分泌細(xì)胞因子產(chǎn)生的級(jí)聯(lián)效應(yīng)，最終導(dǎo)致氣道慢性炎癥。Th2細(xì)胞分泌的IL-4、IL-5、IL-9和IL-13與嗜酸粒細(xì)胞浸潤、氣道高反應(yīng)性、高水平 IgE等密切相關(guān)［2－3］。哮喘氣道的慢性炎癥及重塑最終可導(dǎo)致不可逆性氣流受限及對(duì)激素治療的無反應(yīng)［4］。

miRNA是一類長約為19～25個(gè)核苷酸的小分子RNA。主要通過結(jié)合靶基因mRNA的3'端非翻譯區(qū)(3'-untranslated region，UTR)，參與對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)［5］。近年來發(fā)現(xiàn)，某些miRNAs如miR-126、miR-145、let-7等可以調(diào)節(jié)哮喘氣道炎癥，分別表現(xiàn)出促炎、抗炎或?qū)ρ装Y的雙重作用。通過調(diào)控這些miRNAs的表達(dá)以減輕哮喘的氣道炎癥，或?qū)⒊蔀橄委煹男路椒把芯啃聼狳c(diǎn)。前期實(shí)驗(yàn)中，本課題組按文獻(xiàn)［6］報(bào)道的方法成功構(gòu)建了過敏性哮喘小鼠模型，制備了哮喘模型小鼠的單個(gè)脾細(xì)胞后，用免疫磁珠分選了其CD4+T細(xì)胞，提取其總RNA并用microRNA芯片檢測了miRNA表達(dá)譜。與對(duì)照組相比，哮喘模型小鼠的CD4+T細(xì)胞中共有12種miRNAs表達(dá)升高，如miR-201-3p等(結(jié)果尚未發(fā)表)。該結(jié)果提示，這些miRNAs可能參與了哮喘的發(fā)病過程，尤其是對(duì)CD4+T細(xì)胞的調(diào)控作用。本研究擬通過生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-201-3p的潛在靶基因，并對(duì)這些靶基因進(jìn)行Gene Ontology(GO)基因分類以及KEGG信號(hào)通路富集，以期探究miR-201-3p在哮喘發(fā)病過程中對(duì)CD4+T細(xì)胞可能的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 靶基因預(yù)測 分別用miRanda(http://www.microrna.org/)、miRDB(http://www.mirdb.org/)、miRWalk(http://www.umm.uni-heidelberg.de/)和Targetscan(http://www.targetscan.org/)4 個(gè)數(shù)據(jù)庫在線預(yù)測miR-201-3p的靶基因，并對(duì)獲得的靶基因在4個(gè)數(shù)據(jù)庫中的分布情況構(gòu)建Venn圖。

1.2 靶基因的GO分類 對(duì)1.1中獲得的靶基因，剔除僅出現(xiàn)于2個(gè)或2個(gè)以下數(shù)據(jù)庫的靶基因，剩下的靶基因用于后續(xù)分析。運(yùn)用軟件Cytoscape(2.8.1 版)中的功能插件 BiNGO(2.44 版)進(jìn)行 GO分類并繪圖。選擇物種“Mus musculus”，以Benjamini＆Hochberg's FDR correction進(jìn)行多重檢驗(yàn)，P＜0.01為顯著性閾值。

1.3 靶基因的KEGG信號(hào)通路分析 利用DAVID v6.7 網(wǎng)站(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)中的KEGG(Kyoto encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫，以“Mus musculus”為研究背景，P ＜0.05為顯著性閾值，對(duì)用于GO分類的靶基因進(jìn)行信號(hào)通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)測靶基因 在 miRanda、miRDB、miRWalk和Targetscan 4個(gè)數(shù)據(jù)庫中共預(yù)測獲得5201個(gè)潛在靶基因，這些靶基因在這4個(gè)數(shù)據(jù)庫的分布如圖1所示。由圖1可知，在3個(gè)及3個(gè)以上數(shù)據(jù)庫同時(shí)出現(xiàn)的靶點(diǎn)共計(jì)1082個(gè)靶基因。

圖1 miR-201-3p靶基因在 miRanda、miRDB、miRWalk和Targetscan數(shù)據(jù)庫中的分布Fig 1 The distribution of target genes of miR-201-3p in miRanda，miRDB，miRWalk and Targetscan databases

2.2 Cytoscape的GO 分析

2.2.1 生物學(xué)進(jìn)程分析 對(duì)獲得的miR-201-3p的1082個(gè)靶基因進(jìn)行GO分類，結(jié)果表明:共有963個(gè)靶基因涉及245條生物學(xué)進(jìn)程(圖2，P＜0.01)，其中生物學(xué)進(jìn)程中包含的靶基因數(shù)量排在前4位的分別為細(xì)胞進(jìn)程(cellular process，62.5%)、生物學(xué)調(diào)節(jié)(biological regulation，45.8%)、生物學(xué)進(jìn)程的調(diào)節(jié)(regulation of biological process，43.7%)和細(xì)胞進(jìn)程的調(diào)節(jié)(regulation of cellular process，41.1%)。其他的生物學(xué)進(jìn)程見表1(僅列出前20項(xiàng))。

2.2.2 分子功能分析 對(duì)1082個(gè)靶基因進(jìn)行分子功能分析的結(jié)果表明，這些靶基因的功能包括結(jié)合(binding)、蛋白結(jié)合(protein binding)、催化活性(catalytic activity)等，這些分子功能的關(guān)聯(lián)關(guān)系見圖3。

2.3 KEGG信號(hào)通路 對(duì)1082個(gè)靶基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集的結(jié)果表明:這些靶基因隸屬于30條信號(hào)通路(表2)，其中與炎癥相關(guān)的信號(hào)通路主要包括 MAPK、Wnt、趨化因子、TGF-β、T 細(xì)胞受體、胰島素信號(hào)、VEGF信號(hào)通路等(P＜0.01)。其中，有27個(gè)靶基因出現(xiàn)于 MAPK信號(hào)通路中，如MAP3K7、TRAF2、MAPKAPK2、GNA12 和 MAX 等(圖4);16個(gè)靶基因出現(xiàn)于Wnt信號(hào)通路中，如APC2、PPP2R5D、WNT3A 和 F2D5等(圖5);而T 細(xì)胞受體信號(hào)通路中富集了 PDK1、TRP53和RAF1等12個(gè)基因(圖6)。

表1 miR-201-3p靶基因的生物學(xué)進(jìn)程結(jié)果Tab 1 Biological process of predicted target genes of miR-201-3p

圖2 miR-201-3p靶基因的生物學(xué)進(jìn)程圖Fig 2 Biological process of the predicted target genes of miR-201-3p

圖3 miR-201-3p靶基因的分子功能圖Fig 3 Molecular function of the predicted target genes of miR-201-3p

表2 miR-201-3p預(yù)測靶基因的KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果Tab 2 Pathway enrichment of the predicted target genes of miR-201-3p

圖4 miR-201-3p靶基因在MAPK信號(hào)通路圖中的分布Fig 4 Distribution of the predicted target genes of miR-201-3p in MAPK signaling pathway

圖5 miR-201-3p靶基因在WNT信號(hào)通路圖中的分布Fig 5 Distribution of the predicted target genes of miR-201-3p in WNT signaling pathway

圖6 miR-201-3p靶基因在T細(xì)胞受體信號(hào)通路圖中的分布Fig 6 Distribution of the predicted target genes of miR-201-3p in T cell receptor signaling pathway

3 討論

哮喘為臨床常見疾病，其發(fā)病率逐年升高［1］。miRNA在哮喘的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。Moschos等［7］發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌脂多糖(LPS)誘導(dǎo)了炎性肺組織中miRNA表達(dá)譜的改變。miRNAs在CD4+T細(xì)胞分化發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用，如miR-155可抑制轉(zhuǎn)錄因子c-Maf的表達(dá)，下調(diào)miR-155可促進(jìn)IL-4、IL-5和IL-13等Th2型細(xì)胞因子分泌，同時(shí)降低了 B 和 T 細(xì)胞反應(yīng)［8］。Zhang等［9］研究表明過敏性哮喘患者外周血CD4+T細(xì)胞中miR-155表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)水平與哮喘嚴(yán)重程度相關(guān)，提示miRNA調(diào)控CD4+T細(xì)胞分化在哮喘中發(fā)揮重要作用。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-201-3p在哮喘模型的小鼠脾CD4+T細(xì)胞中表達(dá)升高，提示該miRNA可能參與了哮喘發(fā)病過程中CD4+T細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。

miRNA通過對(duì)靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控，在多種生理、病理過程中發(fā)揮重要作用。Tomankova等［10］研究表明，miRNA在哮喘、肺癌、肺纖維化等肺部疾病中表達(dá)異常，其可通過多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與氣道重塑等病理生理過程。本研究應(yīng)用miRanda、miRDB、miRWalk 和 Targetscan 4 個(gè)數(shù)據(jù)庫對(duì)miR-201-3p的潛在靶基因預(yù)測后，共獲得了5201個(gè)潛在靶基因，其中有1082個(gè)靶基因同時(shí)出現(xiàn)在3個(gè)和3個(gè)以上數(shù)據(jù)庫。進(jìn)一步對(duì)這1082個(gè)靶基因進(jìn)行GO分類后，發(fā)現(xiàn)這些靶基因的分子功能主要是蛋白結(jié)合、催化活性等。KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些靶基因主要存在于與炎癥有關(guān)的信號(hào)通路如 MAPK、Wnt、趨化因子、TGF-β、胰島素信號(hào)、T細(xì)胞受體信號(hào)通路(T cell receptor signaling pathway)、VEGF信號(hào)通路等。

本研究獲得的T細(xì)胞受體信號(hào)通路基因包括PDK1、MAP3K7、CBLB、KRAS、PAK2 等。Park 等［11］將T細(xì)胞的PDK1基因敲除后發(fā)現(xiàn)TCR-CD28信號(hào)無法誘導(dǎo)活化NF-kB或蛋白激酶C-θ的磷酸化，說明PDK1對(duì)整合TCR和CD28之間的信號(hào)至關(guān)重要。KRAS原癌基因是細(xì)胞增殖的重要調(diào)節(jié)因子［12］，研究表明，let-7(一種 miRNA)可通過結(jié)合KRAS的3'UTR進(jìn)而抑制KRAS的表達(dá)，從而抑制非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生［13］。miR-201-3p的靶基因PDK1和KRAS在哮喘發(fā)病過程中是否通過該信號(hào)通路發(fā)揮作用有待于進(jìn)一步研究。

經(jīng)典的MAPK通路(MAP kinase pathway)主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號(hào)通路、c-Jun N端激酶(JNK)/應(yīng)激活化蛋白(SAPK)信號(hào)通路、p38 MAPK信號(hào)通路和ERK5/大絲裂素活化蛋白激酶(BMK1)信號(hào)通路，參與了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、凋亡、分化及生長增殖等多種生理過程。研究證實(shí)p38 MAPK和ERK是煙草煙霧誘發(fā)氣道炎癥和肺氣腫的重要信號(hào)通路［14］。Shin等研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可減弱ERK通路磷酸化從而有效抑制由LPS或吸煙導(dǎo)致的氣道炎癥［15］。Wan等證實(shí)分泌球蛋白(SCGB32A)可限制ERK和JNK通路的磷酸化，從而減輕由LPS所致的氣道炎癥［16］。這些MARK信號(hào)通路既高度特異又存在一定的交叉。p38和 BMK1在 TNF-α誘導(dǎo) cjun轉(zhuǎn)錄的調(diào)控中具有協(xié)同作用。p38和BMK1可分別上調(diào)MEF2A和MEF2D的轉(zhuǎn)錄活性。TNF-α通過激活p38和BMK1，使MEF2A和MEF2D磷酸化，從而誘導(dǎo)MEF2A/MEF2D異源二聚體形成，這在TNF-α誘導(dǎo)的c-jun基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控中起著重要的作用［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，TRAF2、ERK、BMK1、MAPKAPK2、MAP3K、MAX等27個(gè)分子富集于MAPK通路(圖4)，這說明miR-201-3p可能通過該通路參與了哮喘發(fā)病過程中對(duì)CD4+T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。

正常生理狀態(tài)下，干細(xì)胞中β-catenin主要通過啟動(dòng)經(jīng)典的 Wnt/β-catenin通路激活下游基因［18］;而在低氧時(shí)，低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)也促進(jìn)βcatenin活性以調(diào)節(jié) Wnt/β-catenin信號(hào)通路［19］。應(yīng)用DNA微陣列方法發(fā)現(xiàn)在支氣管哮喘患者外周血中的Wnt 5a顯著升高［20］。本研究也發(fā)現(xiàn)有16個(gè)靶基因富集于 Wnt/β-catenin信號(hào)通路(圖5)，提示miR-201-3p可能通過該信號(hào)通路誘發(fā)哮喘的發(fā)生。

總之，本研究預(yù)測了miR-201-3p的靶基因及可能涉及的信號(hào)通路，這些信號(hào)通路在以往研究中已被證實(shí)參與了氣道炎癥與氣道重塑等病理生理過程。但miR-201-3p是否在炎癥和氣道重塑中也通過這些通路進(jìn)行調(diào)節(jié)尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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