齊計(jì)英　劉倩　韓靜　孫華庚　萬閱

摘要：為優(yōu)化藍(lán)莓（Vaccinium Spp）提取工藝，試驗(yàn)選用水浴回流提取方法，研究了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間和液料比等因素對(duì)藍(lán)莓花青素提取的影響，并用Box-Behnken法進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化。結(jié)果表明，藍(lán)莓花青素水浴回流提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)59%、提取溫度62 ℃、提取時(shí)間62 min、液料比8∶1，在此優(yōu)化條件下藍(lán)莓花青素的提取量為8.444 7 mg/g，與理論值8.453 1 mg/g相差不大。

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓（Vaccinium Spp）；花青素；提??；水浴回流；響應(yīng)曲面法

中圖分類號(hào)：S663.9；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）10-2473-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.045

藍(lán)莓（Vaccinium Spp）又名越橘，其富含花青素而且種類豐富[1]?；ㄇ嗨兀ˋnthocyanidin）又稱花色素，是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬黃酮類化合物，多以糖苷的形式存在，也稱花色苷[2]。藍(lán)莓果實(shí)中的花色苷具有改善視力、延緩衰老、抗疲勞、抗癌和消炎作用[3]。據(jù)國(guó)內(nèi)報(bào)道[4-6]，花青素具有抗氧化、清除自由基、抗突變活性、減輕肝功能障礙、降血糖以及抗腫瘤的功能。藍(lán)莓色素具有純天然效應(yīng)和營(yíng)養(yǎng)功能，應(yīng)用于食品中安全性高，對(duì)人體無害，具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景[7]。

響應(yīng)面法是以多元二次回歸數(shù)學(xué)模型為工具，能有效地找到因素間的最優(yōu)組合，相比于傳統(tǒng)的全因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，該法能在更為經(jīng)濟(jì)的試驗(yàn)次數(shù)下得到精確的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，具有周期短、精確度高等優(yōu)點(diǎn)[8]。本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法，以藍(lán)莓花青素提取量為考察指標(biāo)，對(duì)影響藍(lán)莓花青素提取量的一些關(guān)鍵因素進(jìn)行研究，探求水浴回流法提取藍(lán)莓花青素的最佳工藝條件，以便于對(duì)藍(lán)莓資源進(jìn)一步開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

藍(lán)莓，購(gòu)于沈陽家樂福超市；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（UV≥98%），購(gòu)于上海江萊生物科技有限公司；香草醛、無水甲醇、濃鹽酸、無水乙醇、丙酮均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

RRHP-200型高速萬能粉碎機(jī)，歐凱萊芙（香港）有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；UV2800型紫外可見光分光光度儀，北京普析通用有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花青素含量測(cè)定 試驗(yàn)采用鹽酸-香草醛法[9，10]。精確稱取100 mg原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水溶解并定容至100 mL，用移液管移取原花青素溶液1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 mL，分別用去離子水定容至10.00 mL。再精密稱量香草醛4.000 g，用甲醇溶解并定容至100.00 mL。取原花青素溶液1.00 mL，依次加入香草醛-甲醇溶液6.00 mL、濃鹽酸3.00 mL。以甲醇溶液為空白對(duì)照，在500 nm 處測(cè)吸光度。

1.3.2 樣品測(cè)定 準(zhǔn)確稱取藍(lán)莓3 g，按一定的液料比（mL∶g，下同）加入到一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，在一定溫度下水浴回流提取一定的時(shí)間，真空抽濾后，濾液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至少于50 mL，轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中并用相同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液定容至刻度，得到待測(cè)液。

1.3.3 單因素試驗(yàn) 分別考察提取溶劑、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度、液料比對(duì)花青素提取量的影響。

1.3.4 響應(yīng)曲面法試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）4個(gè)因素為自變量，以藍(lán)莓花青素提取量為響應(yīng)值，利用Box-Behnken組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，進(jìn)行水浴回流提取藍(lán)莓花青素條件的優(yōu)化，因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)所取標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度和吸光度數(shù)據(jù)繪制原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。經(jīng)數(shù)據(jù)處理分析獲得原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=12.451x+0.002，r2=0.999。

2.2 提取溶劑對(duì)花青素提取量的影響

以70%甲醇、70%乙醇及70%丙酮為提取溶劑對(duì)花青素提取量的影響見圖2。由圖2可知，溶劑為70%乙醇的花青素提取量比溶劑為70%甲醇和70%丙酮的提取量略高。實(shí)際生產(chǎn)中，用乙醇代替了許多常用的溶劑如甲醇、丙酮、乙醚，因?yàn)檫@些試劑有毒性，不利于粗提取物在食品和藥品中的進(jìn)一步利用[11]，因此試驗(yàn)選擇用乙醇作為提取溶劑。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花青素提取量的影響 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花青素提取量的影響見圖3。由圖3可知，最優(yōu)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，在一定范圍內(nèi)，花青素的提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)提取量最高，繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)提取量反而降低。

2.3.2 提取時(shí)間對(duì)花青素提取量的影響 不同提取時(shí)間對(duì)花青素提取量的影響見圖4。由圖4可知，最優(yōu)提取時(shí)間為60 min，在一定范圍內(nèi)，藍(lán)莓花青素提取量隨著提取時(shí)間增加而增加，超過60 min，花青素提取量反而降低。出現(xiàn)此情況的原因可能是浸提時(shí)間太短，花青素溶出不充分，導(dǎo)致提取液中花青素含量較低；而提取時(shí)間太長(zhǎng)時(shí)，由于花青素穩(wěn)定性較差，在沒有抗氧化劑的溶液系統(tǒng)內(nèi)，會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列的化學(xué)反應(yīng)，部分花青素可能分解，提取量反而降低[12，13]。

2.3.3 提取溫度對(duì)花青素提取量的影響 不同提取溫度對(duì)花青素提取量的影響見圖5。由圖5可知，60 ℃為最優(yōu)提取溫度，在一定范圍內(nèi)，藍(lán)莓花青素提取量隨著溫度的增加而增加，超過一定范圍，花青素提取量反而降低。出現(xiàn)此情況的原因可能是由于溫度低時(shí)，花青素與蛋白質(zhì)、纖維等分離較慢，提取溫度升高增加了化合物溶解性和擴(kuò)散速率，減小了溶劑的黏度，有利于色素的溶出，故提取量升高；但花青素的穩(wěn)定性較差，溫度過高可能導(dǎo)致花青素發(fā)生氧化、聚合[14]，部分花青素可能分解，提取產(chǎn)量反而降低。

2.3.4 液料比對(duì)花青素提取量的影響 不同液料比對(duì)花青素提取量的影響見圖6。由圖6可知，7∶1為最優(yōu)液料比，隨著液料比的增大，藍(lán)莓花青素的提取產(chǎn)量增加，但當(dāng)液料比超過一定范圍后，花青素提取量增加的不明顯，繼續(xù)增加甚至略有降低。其可能原因是液料比過大時(shí)，色素濃度下降，色素分子間作用力變小，其穩(wěn)定性下降而容易分解，導(dǎo)致色素產(chǎn)量下降。由圖6可知，在7∶1至11∶1之間，其花青素的提取量變化不大，考慮到工業(yè)化成本及高的液料比對(duì)后續(xù)的濃縮工作不便，選擇液料比7∶1。

2.4 響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表2結(jié)果，計(jì)算各項(xiàng)回歸系數(shù)，以這些回歸系數(shù)建立藍(lán)莓花青素提取量與乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）4個(gè)因素的數(shù)學(xué)回歸模型。方差分析結(jié)果見表3。由表2可以得出二次回歸方程式為：藍(lán)莓花青素提取量=8.33-0.099A+0.57B+0.32C+0.16D-0.04AB+1×10-2AC+0.39AD-0.24BC+0.042BD+0.078CD-1.11A2-0.08B2-1.21C2-1.27D2。由表3可知，模型的一次項(xiàng)B影響極顯著，C影響顯著，A、D影響不顯著。從F值可以看出，單因素對(duì)提取量的影響順序依次是B>C>D>A，即液料比>提取溫度>提取時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)。二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2影響極顯著，交互項(xiàng)影響不顯著。從整體分析，模型P<0.000 1，表明該二次多項(xiàng)回歸模型高度顯著；失擬項(xiàng)P不顯著，表明模型與實(shí)際情況擬合較好。

對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）4因子兩兩作交互作用分析，其響應(yīng)面見圖7。等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著[14]，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度2因素之間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間2因素之間、提取溫度和液料比2因素之間、提取時(shí)間和液料比2因素之間交互作用顯著。

通過對(duì)以上獲得的二次方程回歸模型進(jìn)行數(shù)學(xué)分析可知，藍(lán)莓花青素水浴回流提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)59%、提取溫度62 ℃、提取時(shí)間62 min、液料比8∶1，在此優(yōu)化條件下，花青素的提取量的理論值為8.453 1 mg/g。為了進(jìn)一步驗(yàn)證響應(yīng)面分析法的可靠性，采用上述最優(yōu)條件提取花青素，重復(fù)3次，測(cè)得藍(lán)莓花青素提取量分別為8.445 1、8.446 0、8.443 0 mg/g，取平均值為8.444 7 mg/g，與理論值相比，相對(duì)誤差較小。因此，采用響應(yīng)面法分析優(yōu)化得到的藍(lán)莓花青素水浴回流提取的參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際操作。

3 小結(jié)

采用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析，建立藍(lán)莓花青素提取的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型。經(jīng)檢驗(yàn)證明該模型是合理可靠的，能夠較好地預(yù)測(cè)藍(lán)莓花青素提取量。利用模型的響應(yīng)面及其等高線，對(duì)影響藍(lán)莓花青素提取量的關(guān)鍵因素及其相互作用進(jìn)行探討，通過分析并考慮到實(shí)際操作的便利性得到的最終優(yōu)化工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)59%、提取溫度62 ℃、提取時(shí)間62 min、液料比8∶1，在此優(yōu)化條件下，花青素的提取量為8.444 7 mg/g。因此，采用響應(yīng)面法分析優(yōu)化得到的藍(lán)莓花青素水浴回流提取的參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際操作，能有效減少工藝操作的盲目性，從而為進(jìn)一步的工業(yè)化提取奠定基礎(chǔ)，以便于對(duì)藍(lán)莓資源進(jìn)一步開發(fā)利用。

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