李蔥蔥　李飛武　譚喜昌　夏蔚　邵改革　龍麗坤

摘要：利用生物信息學(xué)方法優(yōu)化了適用于原核表達(dá)的Bar基因序列密碼子，克隆了Bar基因序列并構(gòu)建了pET28a-Bar融合表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌宿主菌BL21（DE3）。結(jié)果表明，融合表達(dá)載體在大腸桿菌BL21（DE3）菌株中以包涵體形式表達(dá)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT蛋白質(zhì)），并通過鎳離子親和層析純化后獲得了PAT蛋白質(zhì)，該純化蛋白質(zhì)的獲得為利用酶聯(lián)免疫法定量檢測(cè)和篩選轉(zhuǎn)基因植物提供了必要前提。

關(guān)鍵詞：Bar基因；膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶；原核表達(dá)；分離純化

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）10-2515-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.058

Bar基因作為篩選標(biāo)記基因，具有快速、簡(jiǎn)便、高效、轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的假陽性個(gè)體少等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因玉米（Zea mays L.）、大豆（Glycine max）、油菜（Brassica campestris L.）、水稻（Oryza sativa L.）、小麥（Triticum aestivum Linn.）和大麥（Hordeum vulgare L.）植物基因工程研究中[1-3]。Bar基因編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT），其能夠使草丁膦的有效成分——膦絲菌素（PPT）失活，從而解除除草劑的毒性。Bar基因廣泛應(yīng)用于基因工程育種中的抗除草劑基因，也是遺傳轉(zhuǎn)化中的標(biāo)記基因[4]。目前，生物技術(shù)育種的陽性轉(zhuǎn)化體篩選多數(shù)依據(jù)Bar基因表達(dá)的草丁膦除草劑耐受性進(jìn)行表型鑒定篩選。而由于其不同時(shí)代單個(gè)轉(zhuǎn)化體的外源基因表達(dá)穩(wěn)定性未知，表型篩選易受環(huán)境等因素影響，導(dǎo)致了鑒定準(zhǔn)確性不高。轉(zhuǎn)基因植物標(biāo)記基因的檢測(cè)方法主要有表型鑒定、PCR鑒定、ELISA和Western印跡等方法[5]。ELISA分析法特異性高，獲得結(jié)果快，儀器操作簡(jiǎn)單，同時(shí)可降低檢測(cè)成本[6-8]。建立Bar基因原核表達(dá)體系，表達(dá)和純化PAT蛋白質(zhì)可為轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化外源蛋白質(zhì)提供參考，本研究通過密碼子優(yōu)化和全基因合成，獲得了適合原核表達(dá)的Bar基因片段，并分離純化得到的高純度PAT蛋白質(zhì)，可作為抗原為制備多抗和單抗打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 原核表達(dá)載體pET28a （+）、大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）和大腸桿菌DH5α由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所轉(zhuǎn)基因安全評(píng)價(jià)室保存。

1.1.2 酶及試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA聚合酶、dNTPs、引物Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；氨芐青霉素、卡那霉素、IPTG、十二烷基磺酸鈉（SDS）和β-巰基乙醇購自Promega公司；Ni-NTA His Bind Resin、層析柱購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 克隆基因片段 以合成引物PCR擴(kuò)增Bar基因全長，然后用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ內(nèi)切酶分別酶切pET-28a載體和擴(kuò)增片段，將擴(kuò)增片段連接pET-28a載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。利用PCR擴(kuò)增鑒定陽性質(zhì)粒，并將陽性重組質(zhì)粒命名為pET-Bar。提取質(zhì)粒pET-Bar并轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。挑取含pET-Bar質(zhì)粒的單克隆菌落，接種于100 mL含有氨芐青霉素的 LB 培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日用LB（Amp+）稀釋至1 000 mL，37 ℃培養(yǎng)至OD600 nm為1.0左右，加IPTG 至終濃度為1 mol/L。37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h后4 ℃、 5 000 r/min 離心10 min，收集沉淀并用PBS洗滌。

1.2.2 密碼子的優(yōu)化 利用SignalP 3.0 Server軟件預(yù)測(cè)Bar基因序列有無信號(hào)肽及其位置；利用TargetP 1.1Server軟件檢測(cè)此信號(hào)肽的功能。將鏈霉菌中Bar基因密碼子與大腸桿菌偏好密碼子進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)密碼子的兼并性，將Bar基因密碼子改造為大腸桿菌偏好密碼子。

1.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建 將含有目的基因的片段切下并用膠回收試劑盒回收，再與同樣酶切處理的載體pET28a連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，堿解法提取質(zhì)粒，根據(jù)酶切鑒定結(jié)果，篩選含有Bar基因的重組質(zhì)粒命名為pET28a-Bar。搖菌過夜培養(yǎng)，取1 mL菌液送北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司測(cè)序以確定基因序列。

1.2.4 外源基因的誘導(dǎo)表達(dá) 將含有pET28a-Bar表達(dá)載體的BL21 （DE3）菌株于37 ℃活化過夜后，按4∶100稀釋到20 mL含有60 mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中。振蕩培養(yǎng)至OD600 nm為0.6～1.0時(shí)，加入IPTG 至終濃度為0.6 mmol/L，再繼續(xù)培養(yǎng)3 h后12 000 r/min離心5 min后收集菌體，用0.025 mol/L Tris-HCl （pH 8.0）重懸菌體，12 000 r/min離心2 min收集菌體，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 振蕩培養(yǎng)至OD600 nm為0.6時(shí)，加入IPTG后2 h、5 h、過夜誘導(dǎo)，分別取出1 mL菌液，12 000 r/min 離心1 min 收集菌體，菌體置于-20 ℃?zhèn)溆?。以SDS-PAGE 分析不同的表達(dá)時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)量的影響。菌液振蕩培養(yǎng)至OD600 nm為0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度分別為1 mmol/L，分別在37 ℃繼續(xù)誘導(dǎo)5 h以上，其中在每隔1 h均取出1 mL菌液，12 000 r/min離心1 min收集菌體，用SDS-PAGE電泳分析最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間。

1.2.6 目的蛋白質(zhì)的純化 取誘導(dǎo)表達(dá)3 h后的菌液，4 ℃、6 000 r/min 離心20 min收集菌體，將菌體破碎后分別收集可溶性和包涵體表達(dá)的PAT蛋白質(zhì)，利用鎳離子親和層析柱純化，可溶性表達(dá)的PAT蛋白質(zhì)在非變性條件下純化，包涵體形式的PAT蛋白質(zhì)在變性條件下純化。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子的優(yōu)化

利用SignalP 3.0 Server軟件預(yù)測(cè)Bar基因序列有無信號(hào)肽及其位置；利用TargetP 1.1Server軟件檢測(cè)此信號(hào)肽的功能。將鏈霉菌中Bar基因密碼子與大腸桿菌偏好密碼子進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)密碼子的兼并性將Bar基因密碼子改造為大腸桿菌偏好密碼子（圖1）。

2.2 優(yōu)化序列合成

序列確定后在基因的5′端引入BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)，3′端引入Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，并加入保護(hù)堿基進(jìn)行全基因合成。擴(kuò)增Bar基因全長的引物：BarF：5′-CGCGGATCCATGTCTCCG-3′；BarR：5′-CCCAA

GCTTGATTTCGGTAAC-3′。分別用前1～14條和13～26條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，把兩次擴(kuò)增后的產(chǎn)物各取1 μL做模板，用BarF和BarR引物進(jìn)行基因全長擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物見圖3。測(cè)序結(jié)果表明，優(yōu)化前后核苷酸序列同源性為79.89%，氨基酸（183個(gè)）同源性為100%。

2.3 pET28a-Bar表達(dá)載體的構(gòu)建

將Bar基因片段和pET28a載體以BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，T4 DNA連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，然后將陽性質(zhì)粒pET28a-Bar轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中，表達(dá)質(zhì)粒pET28a-Bar酶切鑒定結(jié)果見圖4。

2.4 Bar基因的原核表達(dá)誘導(dǎo)

挑取含有重組陽性質(zhì)粒的單菌落，接種到含有100 mg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，然后1∶100接種于含有氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，OD600 nm為0.4～0.6時(shí)加入IPTG振蕩培養(yǎng)5 h誘導(dǎo)表達(dá)，將蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果（圖5）表明，該重組表達(dá)載體表達(dá)外源蛋白質(zhì)的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為3 h，重組蛋白質(zhì)存在于超聲破碎的沉淀中，所以表達(dá)蛋白質(zhì)為包涵體，為非可溶性的蛋白質(zhì)。

2.5 PAT蛋白質(zhì)的純化

以包涵體形式PAT蛋白分別經(jīng)鎳離子親和層析純化（圖6），純化方法參考文獻(xiàn)[9]，能得到清晰的單一條帶，分子質(zhì)量為27 ku，約占菌體總蛋白質(zhì)的10%。

3 小結(jié)與討論

選擇標(biāo)記基因被廣泛用于轉(zhuǎn)基因植物的研究，由于它們?cè)谵D(zhuǎn)基因植物中出現(xiàn)頻率很高，在轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)過程中，常被作為檢測(cè)方法的靶標(biāo)[10]。Bar基因作為除草劑篩選標(biāo)記基因，具有高效、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[11]。本研究結(jié)果表明，融合表達(dá)載體在大腸桿菌BL21（DE3）菌株中以包涵體形式表達(dá)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT蛋白質(zhì)），并通過鎳離子親和層析純化后獲得了PAT蛋白質(zhì)，該純化蛋白質(zhì)的獲得為利用酶聯(lián)免疫法定量檢測(cè)和篩選轉(zhuǎn)基因植物提供了必要前提。

與高旭東等[13]、劉新光等[14]研究獲得PAT蛋白質(zhì)類似，該表達(dá)PAT蛋白質(zhì)為非可溶的包涵體形式，本研究中獲得的PAT蛋白質(zhì)表達(dá)與其核酸密碼子改造可能無直接相關(guān)[15]。而利用此表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫學(xué)方法獲得的PAT蛋白質(zhì)單克隆抗體，為利用ELISA方法對(duì)Bar基因表達(dá)篩選的方法建立提供了技術(shù)支持，并有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉小紅.Bar基因的轉(zhuǎn)化及抗草丁膦除草劑轉(zhuǎn)基因玉米植株的獲得[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38（1）：25-29.

[2] 邱 龍，馬崇烈，劉博林，等.耐除草劑轉(zhuǎn)基因作物研究現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（12）：2357-2363.

[3] 孫 旭，蘇 翔，凌 磊，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)莖尖轉(zhuǎn)化體系對(duì)不同基因型棉花轉(zhuǎn)化率的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（7）：62-66.

[4] 劉洪艷，弭曉菊，崔繼哲. Bar基因、PAT蛋白和草丁膦的特性與安全性[J].生態(tài)學(xué)雜志，2007，26（6）：938-942.

[5] 許文濤，黃昆侖，鄧愛科，等.轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中PAT 蛋白的酶聯(lián)免疫檢測(cè)[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006，14（2）：250-254.

[6] 郭 斌，祁 洋，尉亞輝.轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].中國生物工程雜志，2010，30（2）：120-126.

[7] 王 敏，張 亮，張 威，等.轉(zhuǎn)基因作物pat蛋白的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法研究[J].分析化學(xué)，2013，41（10）：1555-1560.

[8] 李忠鵬，于寒松，胡耀輝，等.CP4-EPSPS夾心ELISA 配對(duì)單克隆抗體的研制和生物學(xué)特性分析[J].生物技術(shù)通報(bào)，2013（4）：206-209.

[9] HEROUER C，ESDAILE D J，MALLYON B A，et al. Safety evaluation of the phosphinothricin acetyltransferase proteins encoded by the pat and bar sequences that confer to glufosinate-ammonium herbicide in transgenic plants[J]. Regul Toxicol Pharmacol，2005，41（2）：134-149.

[10] 岳運(yùn)鋒，吳 剛，武玉花，等.轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因定性PCR檢測(cè)方法研究[J].中國油料作物學(xué)報(bào)，2011，33（3）：280-289.

[11] 楊朝國，楊方方，張登峰.抗除草劑草丁膦轉(zhuǎn)基因玉米后代篩選方法的研究[J].作物雜志，2010（6）：32-35.

[12] 武淑香，姜志磊，孔祥梅，等.抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米育種篩選方法的建立[J].分子植物育種，2008，6（1）：156-160.

[13] 高旭東，王永志，時(shí)圣鳳，等.膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)及單克隆抗體制備[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2013，29（5）：500-503.

[14] 劉新光，梁念慈，馬澗泉.重組人CK2β亞基的原核表達(dá)純化與鑒定[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2000，27（2）：201-205.

[15] DAVID A M，TATA R，AGHA R，et al.Crystal structure of a putative phosphinothricin acelyltransferase （PA4866） from pseudomonas aeruginosa PAC1[J].Proteins，2005，61（3）：677-679.