盛佳婧 鐘琳 楊朝柱 胡凱 王大平 吳金平 胡中立 刁英

摘要： 為評價魔芋（Amorphophallus konjac）體內(nèi)芋花葉病毒檢測方法，利用人工接種芋花葉病毒的魔芋作為試驗材料，分別采用DAS-ELISA、RT-PCR、熒光定量PCR等3種方法進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，對于人工接種芋花葉病毒1周，植株出現(xiàn)有明顯病征的魔芋，熒光定量PCR檢測的靈敏度最高、RT-PCR次之，而DAS-ELISA酶聯(lián)檢測法靈敏度較低。

關(guān)鍵詞：魔芋（Amorphophallus konjac）；芋花葉病毒；DAS-ELISA；RT-PCR；熒光定量PCR

中圖分類號：S436.32 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）10-2519-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.059

魔芋（Amorphophallus konjac）是天南星科魔芋屬多年生草本植物，已有2 000多年的種植歷史[1]。魔芋是世界上迄今為止發(fā)現(xiàn)的惟一含有大量葡甘聚糖的植物。近年來隨著葡甘聚糖營養(yǎng)保健功能的逐步被發(fā)現(xiàn)和在食品工業(yè)上的廣泛應(yīng)用，魔芋產(chǎn)品的市場需求逐年擴大，但因常年無性繁殖，使病毒積累、種性退化，其豐產(chǎn)性和品質(zhì)無法保證[2]。芋花葉病毒（Dasheen mosaic virus，DsMV）是天南星科植物上發(fā)生最普遍和危害最嚴(yán)重的病毒[3]。

目前植物病毒的檢測方法主要包括生長季隔離檢疫、指示植物接種、血清學(xué)檢測、免疫電鏡和分子生物學(xué)檢測[4，5]。已報道用ELISA和RT-PCR法來檢測魔芋中芋花葉病毒[6]。熒光定量PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上將熒光共振能量轉(zhuǎn)移與熒光標(biāo)記探針結(jié)合，將核酸擴增、雜交、光譜分析和實時檢測技術(shù)融合在一起的一項創(chuàng)造性技術(shù)，它具有快速、靈敏、高通量、特異性強、自動化程度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確定量等特點[7]。實時熒光定量PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、海關(guān)檢驗檢疫、國防軍事、新型農(nóng)業(yè)、基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域[8，9]，尤其在動物醫(yī)學(xué)病理和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛[10]。

本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合植物病毒檢測的特點，采用DAS-ELISA、RT-PCR和熒光定量PCR對魔芋中的芋花葉病毒進(jìn)行檢測，為魔芋病毒的快速診斷提供了技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

芋花葉病毒由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)洪霓教授提供，接種材料為組培得到的清江花魔芋（A. konjac cv. qingjiang）脫毒植株。

1.2 試劑

植物總RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；5×M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖溶液、M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；dNTPs、10×Taq Reaction Buffer、Taq DNA Polymerase、DL2000 Marker購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DSMV ELISA 試劑盒購自美國Rapidbio公司；2×SYBR Master Mix購自TOYOBO公司。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，序列測定由上海桑尼生物科技股份有限公司完成。

1.3 病毒的接種

將帶病毒的新鮮魔芋葉片用液氮研磨至粉末后溶解于接種緩沖液（5 mL PBST，0.1 g PVP-40，

0.005 g BSA，0.022 5 g 銅試劑）中，并用紗布過濾到1.5 mL EP管中，插入冰水中備用。接種前洗凈手指，用干凈的鋼絲球沾取帶病汁液在健康魔芋葉片上摩擦，接種后用無菌水沖洗葉面，去除緩沖液對葉片代謝的影響。接種1周后魔芋葉片出現(xiàn)白色斑點，葉片邊緣出現(xiàn)輕微卷邊的癥狀（圖1），說明芋花葉病毒已經(jīng)成功接種到健康魔芋植株上。

1.4 病毒的檢測

1.4.1 DAS-ELISA檢測 稱取0.3 g的帶病葉片，加入到3 mL PBS（pH 7.4）溶液中，用勻漿器將標(biāo)本充分勻漿，離心20 min收集上清。按照ELISA試劑盒的步驟進(jìn)行操作，測定405 nm 波長下的OD值。數(shù)據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽性對照孔平均值≥1.00，陰性對照平均值≤0.10，臨界值計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15。陰性判定標(biāo)準(zhǔn)：樣品OD405 nm<臨界值者為陰性；陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：樣品OD405 nm≥臨界值者為陽性。

1.4.2 RT-PCR 檢測 參考文獻(xiàn)[6]合成檢測引物（5′-GGGCTTGGGTGATGATGGA-3′，5′-GCCTTTCAGTGTTCTCGCTTG-3′），擴增的目的片段長度為310 bp。采用植物總RNA提取試劑盒提取魔芋葉片總RNA，具體方法依照說明書進(jìn)行。PCR體系采用25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行，包括cDNA 1.5 μL，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），dNTPs 0.5 μL（10 mmol/L），10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2 2 μL（25 mmol/L），Taq DNA酶1 U，ddH2O 15.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，36個循環(huán)；再72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物以1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并將PCR產(chǎn)物送至上海桑尼生物科技股份有限公司進(jìn)行序列測定。

1.4.3 熒光定量PCR檢測 以cDNA（稀釋100倍）為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括cDNA模板2 μL、2×SYBR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL（20 μmol/ L）。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共40個循環(huán)。每個樣品設(shè)定3個平行，反應(yīng)在ABI實時熒光PCR 儀上進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 DAS-ELISA檢測結(jié)果

DAS-ELISA檢測結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，陽性對照1和7的OD405 nm分別為2.987 1、3.172 3；陰性對照2和8的OD405 nm分別為0.080 2、0.073 5；空白對照6的OD405 nm是0.070 2；平行樣品3、4、5的OD405 nm分別為0.981 7、0.706 7、0.123 4；平行樣品9、10、11、12的OD405 nm分別為1.020 6、0.119 3、0.103 6、0.105 2。雖然接種芋花葉病毒的魔芋葉片有稍許顏色反應(yīng)，但達(dá)不到檢測試劑盒要求的陽性標(biāo)準(zhǔn)，DAS-ELISA檢測的靈敏度較低。

2.2 RT-PCR檢測結(jié)果

接種芋花葉病毒的魔芋能擴增到預(yù)期大小的條帶（圖3），而健康魔芋樣本無此片段出現(xiàn)。BLAST比對結(jié)果表明，本研究中擴增的序列與DsMV其他株系的對應(yīng)序列覆蓋率可達(dá)到100%，相似性最高達(dá)到99%，說明所得DNA片段確為DsMV的基因片段。

2.3 熒光定量PCR檢測結(jié)果

熒光定量PCR檢測了稀釋100倍的病毒樣品，檢測到熒光信號，25個循環(huán)數(shù)左右達(dá)到平臺期，條帶特異性較強，能確定是目的序列擴增（圖4）。結(jié)果表明，熒光定量PCR能夠檢測魔芋花葉病毒。

3 小結(jié)與討論

基于免疫學(xué)原理的ELISA相關(guān)方法對設(shè)備要求低、操作簡單、成本偏低，可用于基層大量樣品的檢測等優(yōu)點，廣泛用于病毒的檢測，但往往非特異性反應(yīng)（即假陽性）的問題較普遍，對于某些材料的檢測靈敏度也不夠高。本研究中接種病毒的植株已經(jīng)明顯出現(xiàn)的病癥，但采用ELISA方法進(jìn)行檢測，卻并未得到可靠的陽性結(jié)果?；诜肿由飳W(xué)技術(shù)的RT-PCR方法在反應(yīng)特異性和靈敏度方面大大提高，而且沒有免疫學(xué)方法中制備抗血清的限制，檢測的時間較短，但對于帶毒量偏低的材料仍有其局限性。熒光定量PCR技術(shù)是最近幾年發(fā)展最快的技術(shù)之一，是由熒光技術(shù)和普通PCR擴增系統(tǒng)相結(jié)合，克服了普通PCR技術(shù)的不足，且簡化了檢測過程，特異性和靈敏度都較高，可以用于帶毒量偏低的帶病植株的分子檢測。本研究中熒光定量PCR的模板濃度比RT-PCR低100倍，仍然能夠檢測出陽性結(jié)果，表明熒光定量PCR的靈敏度確實優(yōu)于RT-PCR。但是熒光定量PCR檢測對儀器要求較高，需要專門的熒光定量PCR儀，而RT-PCR在普通的PCR儀上就能進(jìn)行，一般實驗室即可以開展檢測工作。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉佩瑛.魔芋學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003.

[2] 劉文洪，陳集雙，李永偉.浸染天南星科植物病毒的分子鑒定及其分子生態(tài)學(xué)研究[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2004，15（4）：566-570.

[3] 申屠蘇蘇，王海麗，陳集雙，等.三葉半夏的2種病毒檢測[J].中國中藥雜志，2007，32（8）：664-667.

[4] SEUNG K C，JANG K C，WON M P，et al.RT-PCR detection and identification of three species of Cucumo viruses with a genus specific single pair of primers[J]. Journal of Virological Methods，1999，83（1）：67-73.

[5] 張宗義，陳坤榮，許澤永.自然侵染菜豆的花生矮化病毒研究[J].植物病理學(xué)報，1999，29（1）：68-72.

[6] 胡 曉，吳金平，刁 英，等.魔芋中芋花葉病毒的RT-PCR檢測[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，49（1）：9-11.

[7] 徐小剛，劉雅婷.實時熒光定量PCR在植物病害中的應(yīng)用[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2009，25（7）：52-56.

[8] 施林祥，李東輝.熒光PCR研究新進(jìn)展[J].世界華人消化雜志，2005，13（5）：596-599.

[9] 高 斌，劉敬忠.實時熒光PCR技術(shù)的研究及其應(yīng)用進(jìn)展[J].診斷學(xué)理論與實踐，2005，4（6）：507-508.

[10] MIKAEL L，JOSEM A，MARTIN B，et al.The real-time polymerase chain reaction[J]. Molecular Aspects of Medicine， 2006，27：95-l25.