馮建華，吳 剛，汪 麗，徐婷婷

蛋白質(zhì)就像由分子組成的機(jī)器，它是細(xì)胞的基本組成模塊和生命控制中心，蛋白質(zhì)所具有的功能是非常多樣化的，如物質(zhì)酶的活性和輸送就是在相關(guān)蛋白質(zhì)的控制作用下基于對(duì)目標(biāo)分子的高度特定的一種識(shí)別。血清白蛋白是最豐富的載體蛋白質(zhì)類(lèi)之一，它在血液中內(nèi)源性和外源性化合物的輸送和處置過(guò)程中扮演著非常重要的角色。人血清白蛋白（HSA）的生理作用就是在血液中運(yùn)送長(zhǎng)鏈脂肪酸，同時(shí)它也結(jié)合大量的外源性化合物，如藥物、氨基酸、類(lèi)固醇及金屬元素等［1，2］。體內(nèi)大量生物活性物質(zhì)如代謝物、藥物和其它有機(jī)化合物的分布和代謝是與它們對(duì)血清白蛋白的親和力密切相關(guān)的，而血流中藥物白蛋白的結(jié)合性能對(duì)藥物的自由濃度和代謝有非常顯著的影響［2，3］。因此，對(duì)小分子物質(zhì)如染劑、藥物和有毒化學(xué)品等與蛋白質(zhì)之間相互作用的研究已成為生命科學(xué)、化學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的焦點(diǎn)［4，5］。

牛血清蛋白（BSA）是由582種氨基酸殘基構(gòu)成的，是基于二硫鍵和氨基酸序列分布的一種蛋白質(zhì)，可認(rèn)為它是由三種同源域（I、II和III）的物質(zhì)結(jié)合在一起組成的，每個(gè)域又可細(xì)分為A和B兩個(gè)子域。BSA有Trp－134和Trp－212兩種色氨酸，分別內(nèi)嵌在IB和IIA兩個(gè)子域中［3，6］。由于BSA具有價(jià)格低廉、使用方便、不同尋常的配體結(jié)合屬性及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似于人血清白蛋白（HSA）等的特點(diǎn)，而且最重要的是BSA和HSA是同源蛋白質(zhì)。因此，BSA常作為蛋白質(zhì)的典型代表而用于科學(xué)研究。

1，3，5－三羥基苯類(lèi)化合物作為解痙藥之一，主要用于治療胃腸道絞痛。為緩解疼痛并增加社會(huì)勞動(dòng)力，該藥物在二十世紀(jì)七十年代及八十年代前期而被廣泛使用［5］。目前，該類(lèi)化合物已用作醛類(lèi)化合物的檢測(cè)劑，同時(shí)也應(yīng)用于重氮型復(fù)印和紡織印染行業(yè)。此外，1，3，5－三羥基苯衍生物是廣泛存在于桃金娘科藥用植物中次生代謝物的一個(gè)主要種類(lèi)，同時(shí)也存在于藤黃科、大戟科、叉蕨科、菊科、蕓香料、薔薇科、金絲桃科、樟科、景天科、大麻科及殼斗科等植物系列中。研究表明，在海洋和微生物資源中也發(fā)現(xiàn)了該類(lèi)化合物的存在［6］。本文中，我們采用熒光光譜及同步熒光光譜法對(duì)1，3，5－三羥基苯與BSA之間的作用機(jī)理進(jìn)行了研究，考察了二者之間相互作用的熱力學(xué)參數(shù)、結(jié)合常數(shù)及1，3，5－三羥基苯對(duì)BSA構(gòu)象的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

牛血清蛋白（BSA，合肥博美生物科技有限公司，純度99%）；1，3，5－三羥基苯（上海化學(xué)試劑公司）；其余試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；經(jīng)檢測(cè)均無(wú)熒光雜質(zhì)。VARIAN Cary 100熒光分光光度計(jì)（帶恒溫裝置，美國(guó)VARIAN公司）；智能型超級(jí)恒溫水槽ZC－10（寧波天恒儀器廠）；pB－10型精密pH計(jì)（塞多利斯科學(xué)儀器有限公司）；AY－120M電子分析天平（日本島津公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

數(shù)據(jù)處理用Origin6.10.52進(jìn)行。以pH＝7.4的磷酸鹽緩沖劑為試劑，配制濃度為1×10－5mol／L的牛血清蛋白（BSA）試樣，過(guò)夜使其均衡。以具有內(nèi)源熒光的蛋白質(zhì)作為熒光探針，采用熒光猝滅法對(duì)1，3，5－三羥基苯與BSA相互作用的結(jié)果進(jìn)行研究。以10mL BSA試樣為固定體積，在1，3，5－三羥基苯與蛋白質(zhì)比率為0－50系列范圍內(nèi)，分別向試樣中加入份量逐漸增加的1，3，5－三羥基苯樣品以獲得不同的絡(luò)合產(chǎn)物。在激發(fā)波長(zhǎng)為286nm下得到穩(wěn)態(tài)的熒光光譜；在Δλ（Δλ＝λem－λex）分別為15nm（Tyr）和60nm（Trp）條件下，測(cè)定并得到同步熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 1，3，5－三羥基苯濃度的影響

對(duì)于生物大分子來(lái)說(shuō)，熒光性質(zhì)的測(cè)定能給出小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互結(jié)合作用的一些信息，如結(jié)合機(jī)理、結(jié)合模式、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)及分子間距離等。一種化合物的熒光強(qiáng)度可以通過(guò)各種各樣的分子間的相互作用得到減弱，如激發(fā)態(tài)反應(yīng)、分子重組、能量轉(zhuǎn)移、基態(tài)復(fù)合物的形成及碰撞猝滅等，這種強(qiáng)度上的減弱被稱(chēng)為猝滅［7，8］。BSA中含有三種固有的熒光素可以被猝滅，即色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸。BSA的熒光主要源于色氨酸（約340nm）和酪氨酸（約315nm）殘基的輻射。在激發(fā)波長(zhǎng)為286nm下，BSA具有較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰，其峰值在346nm處。固有的蛋白質(zhì)熒光性的猝滅可以用來(lái)檢索許多配體與蛋白質(zhì)的結(jié)合作用信息。當(dāng)BSA與1，3，5－三羥基苯相互作用時(shí)，隨著1，3，5－三羥基苯濃度的不斷增加，BSA的熒光發(fā)射強(qiáng)度逐漸被猝滅（見(jiàn)圖1）。

圖1 1，3，5－三羥基苯濃度的增加對(duì)BSA熒光猝滅的影響（BSA濃度為1×10－5 mol／L；1，3，5－三羥基苯濃度1－5分別為0，5×10－5，1×10－4，2×10－4，5×10－4 mol／L）

由于1，3，5－三羥基苯對(duì)BSA的固有熒光性能具有猝滅作用，我們使用它作為猝滅劑并分析其猝滅機(jī)理。猝滅機(jī)理通?？煞譃閯?dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅，由于溫度的升高會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)散系數(shù)的增大，動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)將隨著溫度的升高而增大；相反，升高溫度可能會(huì)導(dǎo)致化合物的穩(wěn)定性降低，因此靜態(tài)猝滅常數(shù)隨著溫度的增加將會(huì)減少［9］。為了確認(rèn)BSA與1，3，5－三羥基苯之間相互作用的猝滅機(jī)理，我們通過(guò)Stern－Volmer方程分析了不同溫度下的熒光光譜。

方程式中F0和F分別為有猝滅劑與沒(méi)有猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度，［Q］表示猝滅劑的濃度，τ0為猝滅劑不存在時(shí)的熒光壽命，kq代表生物大分子的猝滅速率常數(shù)，KSV表示Stern－Volmer猝滅常數(shù)。以F0／F為縱坐標(biāo)，［Q］為橫坐標(biāo)，在284K和303K下分析得到的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)見(jiàn)圖2，通過(guò)F0／F對(duì)［Q］的線(xiàn)性回歸，由方程式（1）可確定KSV的值。當(dāng)1，3，5－三羥基苯與BSA的比例在2到50范圍內(nèi)變化時(shí)，很明顯圖中的曲線(xiàn)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，表明產(chǎn)生的熒光猝滅是動(dòng)態(tài)猝滅或靜態(tài)猝滅。一般來(lái)說(shuō)，可根據(jù)它們所依賴(lài)的溫度的不同來(lái)區(qū)分動(dòng)態(tài)或靜態(tài)猝滅［10］。根據(jù)方程式（1），回歸曲線(xiàn)的斜率就是Stern－Volmer猝滅常數(shù)。圖2表明了在284K和303K下1，3，5－三羥基苯對(duì)BSA熒光猝滅過(guò)程的Stern－Volmer曲線(xiàn)，可以看出在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，所得結(jié)果與Stern－Volmer方程具有較好的吻合關(guān)系。Stern－Volmer猝滅常數(shù)KSV在284K下等于2380 M－1？傆hs（R＝0.98425），而 在303K 時(shí) 為9022M－1？傆 hs（R＝0.97055），說(shuō) 明 Stern－Volmer猝滅常數(shù)是隨著溫度的升高而不斷增大的，表明1，3，5－三羥基苯與BSA之間的相互作用導(dǎo)致的熒光猝滅可歸屬為動(dòng)態(tài)猝滅機(jī)理。

圖2 284K和303K時(shí)BSA猝滅過(guò)程的Stern－Volmer曲線(xiàn)圖

2.2 1，3，5－三羥基苯與BSA之間的相互作用力

小分子物質(zhì)和蛋白質(zhì)大分子之間主要存在四種相互作用力，即氫鍵、疏水作用力、靜電作用力及范德華力。一種絡(luò)合物的形成常常伴隨有一定的熱力學(xué)過(guò)程。蛋白質(zhì)與小分子之間的作用力類(lèi)型可由熱力學(xué)參數(shù)ΔHΘ和ΔSΘ的值來(lái)確定。和溫度有關(guān)的熱力學(xué)參數(shù)如焓變化ΔHΘ、熵變化ΔSΘ及自由能變化ΔGΘ可用來(lái)描述1，3，5－三羥基苯與BSA之間的相互作用。實(shí)際上，ΔGΘ反映的是反應(yīng)過(guò)程的自發(fā)性，而ΔHΘ和ΔSΘ則是用來(lái)確定作用力的主要證據(jù)。當(dāng)ΔHΘ≈0，ΔSΘ＞0時(shí)，疏水作用力占主要地位；當(dāng)ΔHΘ＜0，ΔSΘ＞0時(shí)，主要作用力是靜電效應(yīng)；當(dāng)ΔHΘ＜0，ΔSΘ＜0時(shí)，此時(shí)的作用力則主要是范德華力和氫鍵作用［11］。

結(jié)合參數(shù)的估算是基于經(jīng)典的Scatchard方程，其可用一個(gè)分析函數(shù)的形式來(lái)表達(dá)平衡態(tài)時(shí)自由配體的濃度與配體總濃度的關(guān)系。式（2）中K是結(jié)合常 數(shù)，n表 示 結(jié) 合 位 點(diǎn) 數(shù)；而 ［1，3，5－Trihydroxybenzene］和［BSA］分別代表配體總濃度與蛋白質(zhì)總濃度。以Lg（（F0－F）／F）和lg（1／（［1，3，5－Trihydroxybenzene］－［BSA］（F0－F）／F0））分別為縱、橫坐標(biāo)，根據(jù)方程式（2）得到的擬合曲線(xiàn)如圖3；由擬合曲線(xiàn)的斜率和截距計(jì)算得到的相關(guān)結(jié)合參數(shù)列于表1。由結(jié)果可知，室溫下n約為0.6，表明室溫時(shí)1個(gè)BSA分子結(jié)合了0.6個(gè)1，3，5－三羥基苯分子；溫度升高，n值則將減小。當(dāng)溫度在小范圍內(nèi)變化時(shí)，可以認(rèn)為ΔHΘ是一常數(shù)，通過(guò)已得到的猝滅常數(shù)K，再由下列方程式可計(jì)算得到表1中的熱力學(xué)參數(shù)。

圖3 由方程式（2）得到用于確定結(jié)合參數(shù)的擬合曲線(xiàn)圖（［BSA］＝1×10－5 mol／L，λex＝286nm，λem＝346nm）

表1 修正的Stern－Volmer締合常數(shù)（K）和1，3，5－三羥基苯－BSA體系的相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)

由表1可知，ΔGΘ均為負(fù)值，表明1，3，5－三羥基苯與BSA的結(jié)合是自發(fā)性的。室溫下，熱力學(xué)參數(shù)ΔHΘ＝69.20kJ·mol－1，ΔGΘ＝ －35.35kJ·mol－1，ΔSΘ＝ 344.8J·mol－1·K－1。ΔGΘ為負(fù)值，說(shuō)明二者之間的相互作用過(guò)程是自發(fā)的；而ΔHΘ和ΔSΘ均為正值，則表明BSA與1，3，5－三羥基苯相互作用過(guò)程中疏水作用力起了主要作用［12］，而氫鍵是次要作用力。

2.3 同步熒光光譜

同步熒光光譜法是常見(jiàn)的用于評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的一種方法，它能給出發(fā)色團(tuán)如色氨酸和酪氨酸等附近有關(guān)分子環(huán)境的一些信息。最大發(fā)射峰的轉(zhuǎn)移反映了發(fā)色團(tuán)分子附近極性的變化［10］。當(dāng)介于激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)之間的Δλ等于60 nm時(shí)，同步熒光光譜能測(cè)得色氨酸殘基的特征信息；當(dāng)Δλ設(shè)定為15nm時(shí)，能得到酪氨酸殘基的光譜特征［11，12］。在兩種不同波段下得到的同步熒光光譜分別見(jiàn)圖4和圖5。

圖4 1，3，5－三羥基苯對(duì)BSA同步熒光發(fā)射的影響（Δλ＝60nm，303K）

圖5 1，3，5－三羥基苯對(duì)BSA同步熒光發(fā)射的影響（Δλ＝15nm，303K）

由圖4和圖5可以看出，BSA中色氨酸和酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了紅移，表明在1，3，5－三羥基苯作用下，胰蛋白酶的構(gòu)象發(fā)生了變化，色氨酸和酪氨酸殘基附近的極性增大了，而疏水性則有所降低。

3 結(jié) 論

在模擬生理?xiàng)l件下，采用穩(wěn)態(tài)熒光光譜、同步熒光光譜等對(duì)1，3，5－三羥基苯與BSA之間的結(jié)合作用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，二者之間具有明顯的結(jié)合作用，其相互作用導(dǎo)致的熒光猝滅為動(dòng)態(tài)猝滅。從實(shí)驗(yàn)得到BSA中色氨酸和酪氨酸殘基的熒光猝滅過(guò)程可知，1，3，5－三羥基苯和BSA之間的顯著結(jié)合作用確實(shí)改變了這些殘基上的微環(huán)境。此外，同步熒光光譜中發(fā)生的紅移現(xiàn)象也表明了二者結(jié)合作用后氨基酸微環(huán)境極性的增加。

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