董萍 彭海英 高璐 趙洪禮

重組Apoptin的葉酸修飾及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡活性研究

董萍 彭海英 高璐 趙洪禮

為了使重組GST-Apoptin融合蛋白能夠與腫瘤細(xì)胞靶向性結(jié)合，并發(fā)揮其特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，本文采用化學(xué)方法將葉酸連接到GST-Apoptin融合蛋白，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葉酸與GST-Apoptin融合蛋白的偶聯(lián)率為6%，最佳偶聯(lián)條件是20 mg/mL活化葉酸在pH 10.0條件下室溫反應(yīng)60 min。葉酸化的GST-Apoptin融合蛋白（folate-GST-Apoptin）具有顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用，1.0 μg/mL的folate-GST-Apoptin可使50%的腫瘤細(xì)胞（KG-1）凋亡，而對正常人外周血淋巴細(xì)胞沒有誘導(dǎo)凋亡作用。

凋亡；葉酸；Apoptin

來源于雞貧血病毒的雞貧血病毒蛋白-3(vp3)對人的各種腫瘤細(xì)胞和異常轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有特異性殺傷作用。由于vp3能夠選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的凋亡，而不誘導(dǎo)正常細(xì)胞的凋亡，被命名為腫瘤特異性凋亡因子(Apoptin)[1-3]。研究結(jié)果表明，Apoptin誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡不依賴于抑癌基因-53(p53)作用途徑，也不被抑制細(xì)胞凋亡基因(Bcl-2)過量表達(dá)所抑制，因此有希望成為有效治療癌癥的新型生物制劑[4-5]。由于人腫瘤細(xì)胞表面沒有雞貧血病毒蛋白受體，故Apoptin蛋白不可能與人的腫瘤細(xì)胞結(jié)合而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦證明了這一點(diǎn)。為解決這一問題，本研究建立了重組GST-Apoptin融合蛋白葉酸修飾方法，以激活GST-Apoptin誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性，使GST-Apoptin融合蛋白能夠與腫瘤細(xì)胞發(fā)生靶向結(jié)合，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，以達(dá)到能夠滿足臨床治療腫瘤的目的。

1 材料和方法

1.1 儀器設(shè)備 Unic 2101型紫外可見分光光度計(jì)(上海Unic公司)、Startorious 1721型電子天平(德國)、85-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠)、SHZ-88-1型臺(tái)式水浴恒溫振蕩器(江蘇太倉鹿河生化儀器廠)。

1.2 細(xì)胞與試劑 人KG1細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞所，常規(guī)傳代培養(yǎng)KG1細(xì)胞；葉酸(Sigma產(chǎn)品)，GST-Apoptin本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)純化，其他所用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)，分析純。

1.3 GST-Apoptin融合蛋白的化學(xué)化修飾

1.3.1 GST-Apoptin融合蛋白預(yù)處理 取純化的GST-Apoptin融合蛋白溶解(1.5 mg/mL)10 mL，調(diào)至pH 9.0，室溫?cái)嚢柘戮徛渭尤?5%的戊二醛溶液(終濃度為0.2%)，攪拌12 h，對上述平衡液透析24 h，即得戊二醛活化GST-Apoptin融合蛋白的懸液。

1.3.2 葉酸活性酯的制備 500 mg的葉酸溶于10 mL二甲亞砜(已預(yù)先加入0.25 mL的三乙胺)，攪拌下加入適量的二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，室溫反應(yīng)過夜。過濾，除去反應(yīng)中生成的副產(chǎn)物二環(huán)己基脲，減壓濃縮至干。用乙醚洗滌殘余固體，得淺黃色固體粉末，即葉酸活性酯。

1.3.3 Folate-GST-Apoptin的制備 取上述活化的GST-Apoptin液適量2 mL，加入30 mg/mL的葉酸活性酯的二甲亞砜溶液0.5 mL，室溫?cái)嚢? h。用Sephadex G-50葡聚糖凝膠柱去除游離的葉酸，收集先流出的有乳光部分，即Folate-GST-Apoptin膠體混懸液。過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 Folate-GST-Apoptin偶聯(lián)的證明及偶聯(lián)程度的測定 將GST-Apoptin、Folate-GST-Apoptin和葉酸與GST-Apoptin混合物的胰蛋白酶水解液分別作紫外吸收圖譜分析，驗(yàn)證葉酸是否與GST-Apoptin偶聯(lián)。同時(shí)將葉酸配制成2～40 μg/mL系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，在358 nm處測定吸收度。

1.4 GST-Apoptin融合蛋白的化學(xué)化修飾制備工藝的優(yōu)化

1.4.1 葉酸活性酯用量對偶聯(lián)程度的影響 5份GST-Apoptin融合蛋白活化混懸液用NaCO3/NaHCO3緩沖溶液調(diào)pH為10，加入不同量葉酸活性酯的二甲亞砜溶液，室溫?cái)嚢?，即Folate-GST-Apoptin膠體混懸液。用Sephadex G-50葡聚糖凝膠柱進(jìn)行分離，收集先流出的有乳光部分，加入適量胰蛋白酶液，37℃水解，水解液在358 rim處作吸光度測定。

1.4.2 反應(yīng)時(shí)間對葉酸偶聯(lián)程度的影響 取GST-Apoptin融合蛋白活化混懸液，用NaCO3/NaHCO3。緩沖溶液調(diào)pH為10，加入適量的葉酸活性酯二甲亞砜溶液，室溫?cái)嚢琛６〞r(shí)取一定體積的反應(yīng)液用Sephadex G-50葡聚糖凝膠柱進(jìn)行分離，收集先流出的有乳光部分，加入適量胰蛋白酶液，37℃水解，水解液在358 nm處作吸光度測定。

1.4.3 pH值對葉酸偶聯(lián)程度的影響 由于葉酸活性酯在中性及酸性溶液中溶解度不好，在pH＜9的溶液中易析出沉淀，因此選擇了9.0、9.5、10.0、10.5、11.0五個(gè)pH值來考察偶聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行程度。取5份GST-Apoptin融合蛋白活化混懸液，用NaCO3/NaHCO3緩沖溶液分別調(diào)pH為9.0、9.5、10.0、10.5、11.0，加入適量的葉酸活性酯二甲亞砜溶液，室溫?cái)嚢?。用Sephadex G-50葡聚糖凝膠柱進(jìn)行分離，收集先流出的有乳光部分，加入適量的胰蛋白酶液，37℃水解，水解液在358 nm處作吸光度測定。

1.5 Folate-GST-Apoptin體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用 采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法測定Folate-GST-Apoptin誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的活性；人KG1細(xì)胞株(購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞所)；常規(guī)傳代培養(yǎng)KG1細(xì)胞；取生長良好的細(xì)胞，配制成4×103個(gè)/mL的細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，0.1 mL/孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)過夜；加入上述激活的apoptin，0.1 mL/孔，以125 μg/mL為起點(diǎn)，2倍稀釋，每個(gè)滴度作4孔；37 ℃，5%CO2培養(yǎng)72 h；吸棄培養(yǎng)上清液，用磷酸鹽緩沖液洗細(xì)胞2次；加入用無酚紅RPMI1640配制的MTT(1 mg/mL)，50 μL/孔，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)3 h；吸棄培養(yǎng)上清液，用磷酸鹽緩沖液洗細(xì)胞2次；加入二甲基亞砜(DMSO)，50 μL/孔，37℃，10 min；用EL340 560 nm波長，檢測各孔A值。試驗(yàn)設(shè)PBS組、葉酸組、GST-Apoptin組和葉酸＋GST-Apoptin組對照。

2 結(jié)果

2.1 Folate-GST-Apoptin偶聯(lián)的證明及偶聯(lián)程度的測定 GST-Apoptin的胰蛋白酶水解液紫外吸收圖譜為典型的蛋白質(zhì)紫外吸收圖譜(圖1A)，只在210 nm和280 nm處有吸收峰；而Folate-GST-Apoptin胰蛋白酶水解液紫外吸收圖譜除有典型的蛋白質(zhì)紫外吸收圖譜外(圖1B)，在358 nm處有明顯的紫外吸收；并且與葉酸與GST-Apoptin混合物的胰蛋白酶水解液紫外吸收圖譜基本一致(圖1C)；說明葉酸已經(jīng)連接到GST-Apoptin。

圖1 GST-Apoptin(A)、葉酸偶聯(lián)GST-Apoptin(B)、葉酸G與GST-Apoptin混合物(C)的胰蛋白酶水解液紫外圖譜

2.2 Folate-GST-Apoptin制備工藝的優(yōu)化 ①pH值對葉酸偶聯(lián)程度的影響(圖2)，可以看出葉酸偶聯(lián)GST-Apoptin的反應(yīng)最好在pH＝10時(shí)進(jìn)行。②反應(yīng)時(shí)間對葉酸偶聯(lián)程度的影響(圖3)，可以看出反應(yīng)60 min后，反應(yīng)基本達(dá)到平衡，增加反應(yīng)時(shí)間對葉酸偶聯(lián)量的增加沒有太大影響。③葉酸活性酯用量對葉酸偶聯(lián)程度的影響(圖4)，可以看出葉酸活性酯的用量為15 mg時(shí)，葉酸偶聯(lián)量不再增加。

采用上述最佳條件，pH 10.0，反應(yīng)時(shí)間為60 min，葉酸活性用量為15 mg，得到葉酸偶聯(lián)量為60.0 μg/mg GST-Apoptin的folate-GST-Apoptin。

2.3 Folate-GST-Apoptin對KG1細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用結(jié)果 1.0 μg/mL活化的apoptin可使50%以上的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡(圖5)。而未葉酸修飾的GST-Apoptin組細(xì)胞與正常對照組細(xì)胞沒有差異。

圖2 pH值對葉酸偶聯(lián)量的影響

圖3 反應(yīng)時(shí)間對葉酸偶聯(lián)量的影響

圖4 葉酸濃度對葉酸偶聯(lián)量的影響

圖5 葉酸修飾GST-Apoptin對KG1細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用

3 討論

業(yè)已證明，Apoptin對人體各種組織器官來源的腫瘤細(xì)胞具有不同程度的凋亡誘導(dǎo)作用，而對正常組織細(xì)胞沒有毒副作用，是迄今發(fā)現(xiàn)的沒有毒副作用的抗腫瘤蛋白。但是由于種屬間的差異，Apoptin的裸蛋白不能自主進(jìn)入人體來源的細(xì)胞，包括正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。為了解決這一問題人們通常采用病毒載體(如腺病毒)將Apoptin基因轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞來發(fā)揮其抗腫瘤作用[6]；也有學(xué)者采用微注射的方法將重組的Apoptin蛋白注射到腫瘤細(xì)胞內(nèi)，研究其抗腫瘤作用[7-8]。但這兩種技術(shù)方法只適合實(shí)驗(yàn)室研究，而不利于臨床應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化。

眾所周知腫瘤細(xì)胞表面有豐富的葉酸受體，其受體數(shù)量是正常細(xì)胞的數(shù)十倍之多，已經(jīng)成為腫瘤治療的一個(gè)新的靶向性靶點(diǎn)[9]。本文采用化學(xué)方法將葉酸連接到重組的GST-Apoptin蛋白，以期解決GST-Apoptin進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的理論問題，獲得令人滿意結(jié)果，并獲得國家發(fā)明專利授權(quán)。

由于葉酸與GST-Apoptin表面的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵，胰蛋白酶水解蛋白是不完全水解，僅把蛋白水解成小肽。胰蛋白酶水解之后，并不能完全得到游離的葉酸，有部分的葉酸可能還與小肽相連接。GST-Apoptin的胰蛋白酶水解液在358 nm處基本無吸收，以GST-Apoptin胰蛋白酶水解液作為對照，可消除白蛋白的影響，使其不會(huì)干擾葉酸偶聯(lián)量的測定。因而，采用紫外分光光度法測定葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的葉酸偶聯(lián)量。以A對葉酸濃度C進(jìn)行線性回歸，得回歸直線方程為A＝0.019 6±0.002 5，r＝0.999 9，葉酸濃度C在2～41 g/mL范圍內(nèi)線性良好，這不僅證明了葉酸已經(jīng)連接到GST-Apoptin蛋白上，而且能進(jìn)行定量分析。優(yōu)化了葉酸與GST-Apoptin蛋白連接反應(yīng)條件，并證實(shí)葉酸化的GST-Apoptin蛋白對腫瘤細(xì)胞具有很好的凋亡誘導(dǎo)功能，為其進(jìn)一步的深入研究和產(chǎn)業(yè)化打下了理論基礎(chǔ)。

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To integrate fusion protein of recombined GST-Apoptin with cancer cell targeting so as to exert its function of peculiar induced tumor cell apoptosis.The paper adopts chemical process to connect folic acid with fusion protein of GST-Apoptin，and experiments show that the coupling rate of folic acid and fusion protein of GST-Apoptin is 6%，and the best coupling condition is 20 mg/mL excited folic acid reacts for 60 minutes in indoor temperature with pH 10.0.Folate-GST-Apoptin bears remarkable function of induced tumor cell apoptosis，and 1.0 μg/mL folate-GST-Apoptin can achieve 50%of tumor cell(KG-1)apoptosis，while having no function of induced tumor cell apoptosis on peripheral blood lymphocyte of normal people.

Apoptosis；Folic acid；Apoptin

2014-06-17)

1005-619X(2015)01-0007-03

10.13517/j.cnki.ccm.2015.01.003

116013沈陽軍區(qū)大連療養(yǎng)院桃源療區(qū)檢驗(yàn)科