付德來，種 鐵，李和程，張 鵬，劉洪濤，王子明

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院：1．泌尿外科，2．麻醉科，陜西西安 710004）

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升。早期腎癌缺乏特異性表現(xiàn)，多由健康查體偶然發(fā)現(xiàn)，約1／3的腎癌患者首次就診時已處于晚期。目前晚期腎癌缺乏有效的治療手段，預(yù)后較差。尋找腎癌標(biāo)志物對于提高腎癌的早期診斷水平、研究腎癌發(fā)病機(jī)制、改善腎癌預(yù)后具有重要意義。本課題以腎癌患者尿液作為研究對象，采用磁珠聯(lián)合 MALDI－TOFMS技術(shù)，探索尿液中可能存在的腎癌多肽標(biāo)志物。

1 材料與方法

1．1 研究對象實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會討論通過，按照知情同意的原則篩選2009年3～12月期間西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院泌尿外科住院的患者，包括腎患者、非腎癌腎臟病變患者（腎積水、腎錯構(gòu)瘤、腎盂癌、腎囊腫、腎結(jié)核、腎結(jié)石），以及另外3名健康志愿者。入組腎癌患者均為行根治性手術(shù)治療的早期腎癌（AJCC腎癌TNM分期T1～2N0M0期）患者，且病理類型為腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）。

1．2 主要儀器及試劑MALDI－TOF－MS質(zhì)譜分析儀購自德國Bruker公司，銅螯合納米磁珠試劑盒購自北京國家生物醫(yī)學(xué)分析中心。

1．3 方法

1．3．1 尿液的收集與處理 收集患者及志愿者晨起空腹第二次排尿中段尿液標(biāo)本約10mL，分為術(shù)前組（腎癌患者入院第7天尿液）、術(shù)后組（腎癌患者術(shù)后第7天尿液）和對照組（非腎癌腎臟病變患者入院第2天和同期健康志愿者尿液）。尿液標(biāo)本經(jīng)低溫離心機(jī)4 000r／min離心10min，獲得的上清液2mL／管分裝，－80℃保存。尿液標(biāo)本從收集到離心完畢分裝凍存需在1h內(nèi)完成。

1．3．2 MALDI－TOF－MS分析尿液多肽組 參考銅螯合納米磁珠試劑盒使用說明書及吳杰等［1］的報(bào)道提取尿液中多肽。獲得的多肽提取液1μL和等體積飽和α－羥基肉桂酸（CCA）基質(zhì)溶液混勻，點(diǎn)在 MALDI不銹鋼靶面上，室溫下自然干燥，放入UltraflexⅢ MALDI－TOF－MS質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測。檢測條件設(shè)置如下：N2激光源，波長337nm，正離子線性模式，掃描相對分子質(zhì)量范圍800～10 000Du，激光能量36%，每個樣疊加2 000張譜圖。

1．3．3 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的處理與分析 參考鐘立業(yè)等［2］的報(bào)道，質(zhì)譜采集獲得的原始數(shù)據(jù)應(yīng)用 MALDI－TOF－MS專門的分析軟件ClinProTools2．2進(jìn)行分析。首先調(diào)入各組樣品的數(shù)據(jù)，對采集圖像進(jìn)行歸一化處理，經(jīng)過基線的平滑、去背景、標(biāo)峰后，產(chǎn)生一張所有樣品的平均譜圖，篩選此譜圖上信噪比≥7的譜峰作為高可信譜峰。調(diào)入各個樣品數(shù)據(jù)，查高可信譜峰在各組不同樣品內(nèi)表達(dá)情況，采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件分析各高可信譜峰在各組表達(dá)情況，組間差異P＜0．05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1．3．4 差異多肽的數(shù)據(jù)庫搜索初步鑒定 有意義多肽采用Tagldent檢索程序搜索 UniProtKB／Swiss－Prot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定。在Tagldent檢索頁面（http：／／us．expasy．org／tools／tagldent．html），在“Mw”一欄輸入目的多肽的分子質(zhì)量，在“Organism name”一欄輸入篩選條件“homo sapiens”，點(diǎn)擊“Start Tagldent”進(jìn)行搜索。

2 結(jié) 果

2．1 基本信息共收集得到167份尿液標(biāo)本，經(jīng)篩選獲得符合入組條件的腎癌患者術(shù)前組、術(shù)后組尿液標(biāo)本各32份，對照組尿液標(biāo)本34份，入組患者基本信息無明顯差異（表1）。

表1 研究對象基本資料

2．2 各組尿多肽表達(dá)譜術(shù)前組、術(shù)后組、對照組分別共檢測到115、105、128個多肽信號峰，分析發(fā)現(xiàn)84．48%的信號峰集中分布于 ［1 000～6 000Du］之間，僅有13．51%的信號峰分布于 ［6 001～10 000Du］之間（圖1）。ClinProTools 2．2對所有樣品譜圖歸一化處理后獲得平均譜圖，在相對分子質(zhì)量800～10 000Du范圍內(nèi)，共鑒定出信噪比≥7的高可信多肽峰12個，其m／z分別為854、1 025、1 116、1 315、2 790、3 176、3 297、4 750、5 557、8 817、9 730、9 923。各組之間信號峰集合分布既相互獨(dú)立又有交集（圖2）。

2．3 差異多肽峰篩選以峰面積代表多肽的表達(dá)量，比較信噪比≥7的高可信多肽在各組表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)m／z＝1 025、1 116的多肽在術(shù)前組高表達(dá)，同時在術(shù)后組、對照組低表達(dá)。m／z＝9 730的多肽在術(shù)后組、對照組高表達(dá)，在術(shù)前組低表達(dá)。m／z＝2 790、4 750的多肽在三組表達(dá)無差異（表2、圖3）。其余7個高可信多肽峰表達(dá)不穩(wěn)定，僅出現(xiàn)于個別樣品中。

圖1 各組尿液多肽表達(dá)譜

表2 不同質(zhì)荷比多肽在各組中相對表達(dá)量

2．4 差異多肽峰的檢索鑒定采用Tagldent檢索程序檢索UniProtKB／Swiss－Prot數(shù)據(jù)庫對相關(guān)多肽進(jìn)行初步鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)m／z＝1 025、1 116、9 730的信號峰與多個多肽或蛋白相匹配（表3）。

表3 差異多肽的初步鑒定

圖2 各組多肽信號峰集合分布

圖3 術(shù)前組高表達(dá)（m／z＝1 025、1 116）、低表達(dá)（m／z＝9 730）的多肽

3 討 論

腫瘤標(biāo)志物（tumor marker）是反映腫瘤存在的化學(xué)類物質(zhì)。腎癌標(biāo)志物一方面可以經(jīng)血液循環(huán)、由腎小球過濾進(jìn)入尿液，另一方面可經(jīng)腎小管分泌直接進(jìn)入尿液［3］。尿液采集方便，其蛋白質(zhì)組的組成較血漿簡單，是篩選腎癌標(biāo)志物的理想標(biāo)本。磁珠聯(lián)合MALDI－TOF－MS技術(shù)檢測尿液多肽組具有簡便快速、標(biāo)本用量少的優(yōu)點(diǎn)［1］，已用于腎小球疾病尿液多肽組研究［4］。

尿液多肽組表達(dá)譜受到尿液留存時間、飲食、藥物、疾病、遺傳背景等各種因素的影響。本課題通過選用合理的尿液標(biāo)本和設(shè)計(jì)雙重對照篩選尿液中腎癌特異性多肽標(biāo)志物。首先，為減少尿液留存時間、飲食、藥物對尿液多肽表達(dá)譜多肽表達(dá)譜的影響，本課題采用晨起空腹第二次排尿中段尿液標(biāo)本。同時，本課題對照組包含了健康志愿者和非腎癌腎臟病變（腎積水、腎囊腫、腎血管平滑肌脂肪瘤、腎盂癌、腎結(jié)核、腎結(jié)石），這樣不僅將腎癌患者和健康人尿液多肽譜區(qū)別開來，同時還將腎癌患者和各種非腎癌腎臟病變者尿液多肽譜區(qū)別。另外，本課題還采用腎癌患者術(shù)前術(shù)后自身對照，這樣就減少了基因組差異對尿多肽組的影響。我們期望根治性腎切除術(shù)后尿液中腎癌標(biāo)志分子會減少或消失，所以在患者選擇上僅采用了行根治性腎切除術(shù)的早期腎癌（Ⅰ、Ⅱ期）患者。至于術(shù)后標(biāo)本收集時間點(diǎn)的選擇，目前有限的文獻(xiàn)并沒有明確答案，原則上術(shù)后時間越長尿液中腎癌特異性標(biāo)志物代謝完全的幾率越大?？紤]到實(shí)驗(yàn)的易實(shí)施性，我們收集了患者術(shù)后第7天的尿液標(biāo)本。

3．1 尿液中腎癌多肽標(biāo)志物目前已有多篇文獻(xiàn)通過組學(xué)技術(shù)尋找尿液中腎癌特異性多肽（表4）。分析既往數(shù)據(jù)不難發(fā)現(xiàn)，各研究中篩選出的腎癌相關(guān)分子缺乏一致性，這可能與尿液多肽組表達(dá)譜受眾多因素影響有關(guān)。結(jié)合既往研究進(jìn)一步分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們驚喜發(fā)現(xiàn)，本研究中m／z為1 116的多肽在腎癌組及對照組中的表達(dá)規(guī)律與CHINELLO等［5］的研究一致，這充分說明尿液中m／z為1 116的多肽與腎癌關(guān)系密切，可能是尿液中潛在的腎癌特異性標(biāo)志分子。

表4 腎癌尿液多肽標(biāo)志物研究一覽表

3．2 m／z＝1025多肽初步鑒定分析通過Tagldent檢索程序在UniProtKB／Swiss－Prot數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行初步鑒定，發(fā)現(xiàn)m／z＝1025的多肽與urotensin－ⅡB、little LEN相吻合。Urotensin－ⅡB屬于urotensinⅡ家族，是一個含有8個氨基酸的分泌多肽。UrotensinⅡ最初從蝦虎魚（Goby fish）尾部下垂體中獲得，具有強(qiáng)烈的絲裂原作用。YOSHIMOTO等［10］發(fā)現(xiàn)腎癌VMRC－RCW細(xì)胞系培養(yǎng)液中可檢測到urotensinⅡ表達(dá)，提示腎癌細(xì)胞可分泌urotensinⅡ。外源性給予urotensinⅡ24h后，腎癌VMRC－RCW細(xì)胞密度明顯增加。王文營等［11］通過免疫組化和RTPCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，urotensinⅡ在腎透明細(xì)胞癌和正常腎組織中均有表達(dá)，腎透明細(xì)胞癌中urotensinⅡ及其受體mRNA的表達(dá)明顯高于正常腎組織。

Little LEN是Pro－SAAS（proprotein convertase 1inhibitor）剪切產(chǎn)生的7個片段之一，由10個氨基酸組成。Pro－SAAS參與神經(jīng)內(nèi)分泌通路，可能是內(nèi)源性、特異性PCSK1抑制劑。Little LEN的詳細(xì)功能尚不得而知。

3．3 m／z＝1 116多肽初步鑒定分析Tagldent程序在UniProtKB／Swiss－Prot數(shù)據(jù)庫中檢索發(fā)現(xiàn)m／z＝1 116的多肽與胃泌素釋放肽（gastine－releasing peptide，GRP）吻合。GRP是胃泌素釋放肽前體（proGRP1－125）羧基端的10個肽。HEUSER 等［12］研究發(fā)現(xiàn)GRP受體（GRPR）在RCC細(xì)胞及腫瘤血管高表達(dá)。PANSKY等［13］研究發(fā)現(xiàn)GRPR在腎癌組織中表達(dá)，在正常腎組織中不表達(dá)。最近ISCHIA等［14］通過ELISA、放免法定量檢測腎癌細(xì)胞系GRP表達(dá)及功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN、Caki－1、Caki－2均高表達(dá)GRP，外源性GRP可促進(jìn)體外培養(yǎng)的人腎癌ACHN、Caki－2細(xì)胞增殖，可增強(qiáng)ACHN細(xì)胞的遷移能力。GPR可誘導(dǎo)ACHN、Caki－2細(xì)胞分裂關(guān)鍵酶ERK1／2快速磷酸化，可上調(diào)ACHN腎癌細(xì)胞 HIF1－α、VEGF的表達(dá)。

本研究及CHINELLOC等［5］的研究均提示m／z為1 116的多肽在腎患者尿液中高表達(dá)，Tagldent程序提示此多肽極有可能為GRP。結(jié)合上述研究，我們有理由相信GRP與腎癌關(guān)系密切，GRP在腎癌發(fā)生、發(fā)展中的作用值得深入研究，GRP及其代謝產(chǎn)物在腎癌患者尿液中的檢測價值亦值得進(jìn)一步探討。

3．4 m／z＝9 730多肽初步鑒定分析Tagldent程序檢索發(fā)現(xiàn)m／z＝9 730的多肽與EA－92、Late cornified envelope protein 3C（LCE3C）、Heparin－binding EGF－like growth factor（HB－EGF）相吻合。

EA－92是chromogranin－A剪切產(chǎn)生的13個片段之一。chromogranin－A最早在腎上腺髓質(zhì)嗜鉻顆粒中被發(fā)現(xiàn)，具有穩(wěn)定嗜鉻顆粒的作用，chromogranin－A與兒茶酚胺一起分泌。chromogranin－A在大約90%的腸源性神經(jīng)內(nèi)分泌癌表達(dá)上調(diào)，并且與腫瘤負(fù)荷及復(fù)發(fā)相關(guān)，有效治療后chromogranin－A水平往往下降［15］。chromogranin－A在腎癌中的表達(dá)與腸源性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤存在差異。RASMUSON等［16］早在1999年就對比分析了200例腎癌患者和15例腎囊腫患者chromogranin－A水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)28例（14%）腎癌患者血清chromogranin－A水平升高，但與對照組比較缺乏顯著性差異。多因素分析發(fā)現(xiàn)chromogranin－A不是腎癌預(yù)后影響因子。2010年RONKAINEN等［17］通過免疫組化分析chromogranin－A在152例原發(fā)性腎癌中表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)chromogranin－A免疫組化染色全為陰性。

LCE3C又稱富含脯氨酸的表皮分化小復(fù)合蛋白3A（Small proline－rich－like epidermal differentiation complex protein 3A），主要見于某些皮膚疾?。?8－19］，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的意義尚不明確。

HB－EGF是EGF家族成員之一，可參與胚囊著床、骨骼肌發(fā)育、心肌分化、腎小管形成、傷口修復(fù)和腫瘤發(fā)生。TAKEMURA 等［20］發(fā)現(xiàn)膜結(jié)合 HBEGF可保護(hù)體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞耐受H2O2及足葉乙甙（etoposide）的殺傷，膜結(jié)合 HB－EGF可增加腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞存活率，降低細(xì)胞凋亡。在無血清培養(yǎng)下，膜結(jié)合HB－EGF可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞粘附并形成上皮細(xì)胞克隆。無血清培養(yǎng)3d后膜結(jié)合HB－EGF組細(xì)胞存活率84%，對照組存活率0%。大鼠正常腎小管細(xì)胞轉(zhuǎn)染HB－EGF后可誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化［21］。SCHAFER 等［22］研究發(fā)現(xiàn) HBEGF可特異性地誘導(dǎo)腎癌Caki2、ACHN、A498細(xì)胞系EGFR的過度轉(zhuǎn)錄激活。

本研究中m／z＝9 730的多肽在腎癌術(shù)前組低表達(dá)，在腎癌術(shù)后組、對照組高表達(dá)，結(jié)合目前EA－92、LCE3C、HB－EGF有關(guān)研究結(jié)果，本研究中 m／z＝9 730的多肽與EA－92有關(guān)研究相吻合。EA－92及其前體chromogranin－A在腎癌中低表達(dá)，EA－92及chromogranin－A與腎癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。

本研究通過磁珠聯(lián)合 MALDI－TOF－MS技術(shù)分析腎癌術(shù)前組、腎癌術(shù)后組及對照組尿液中多肽標(biāo)志物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三個多肽差異表達(dá)（m／z＝1 025、1 116的多肽在腎癌術(shù)前組高表達(dá)，m／z＝9 730的多肽在腎癌術(shù)前組低表達(dá)）。通過Tagldent檢索程序在UniProtKB／Swiss－Prot數(shù)據(jù)庫中對這些多肽進(jìn)行初步鑒定發(fā)現(xiàn)了多個匹配分子。這些多肽或其對應(yīng)的蛋白在腎癌和／或腎癌患者尿液中的表達(dá)需進(jìn)一步明確，其作為尿液中腎癌標(biāo)志分子的意義值得深入研究。

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