黃兆浪，林克榮，溫莉虹，張仕鏘，張品南（. 蒼南縣人民醫(yī)院，浙江 溫州 35800；. 溫州市人民醫(yī)院，浙江 溫州 35000）

Fas、C-myc在異位子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)及意義

黃兆浪1，林克榮1，溫莉虹1，張仕鏘1，張品南2
（1. 蒼南縣人民醫(yī)院，浙江 溫州 325800；2. 溫州市人民醫(yī)院，浙江 溫州 325000）

【摘要】目的 探討凋亡調(diào)節(jié)基因Fas（Fatty acid synthase，F(xiàn)as）、C-myc（Cellular homologue myelocytomatosis of avian virus oncogene，C-myc）在子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis，EM）發(fā)病中的作用。方法 選取2012年1月～2014年12月我院EM患者（處于增生期的異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜與處于分泌期的異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜各62例）124例和非EM患者（處于增生期的宮內(nèi)膜與處于分泌期的宮內(nèi)膜各80例）160例。采用免疫組化Envision法檢測(cè)凋亡調(diào)節(jié)基因Fas、C-myc的表達(dá)情況。結(jié)果 Fas在EM患者的異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜低表達(dá)，而在非EM患者的宮內(nèi)膜高表達(dá)；C-myc在EM患者的異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜高表達(dá)，而在非EM患者的宮內(nèi)膜不表達(dá)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 凋亡調(diào)節(jié)基因Fas、C-myc的差異表達(dá)，可能與EM的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】Fas；C-myc；子宮內(nèi)膜異位；免疫組織化學(xué)；Envision

1885年Von Reeklinghausen[1]首次提出并命名子宮內(nèi)膜異位癥已經(jīng)130多年，人們?nèi)圆荒芎芎玫慕忉孍M發(fā)生的原因與機(jī)制。EM作為“現(xiàn)代病”，是一種具有侵襲性、復(fù)發(fā)性、種植性等惡性生物學(xué)行為的良性疾病，它是生育期婦女的常見病[2-3]，近年來，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)[4]。EM患者在臨床上主要表現(xiàn)為痛經(jīng)、慢性盆腔痛、月經(jīng)異常和不孕等，嚴(yán)重影響現(xiàn)代女性的健康和生活質(zhì)量。目前，對(duì)EM的病因及發(fā)病機(jī)制尚無定論，對(duì)其治療的效果仍很局限，難以得到根治。有研究表明，異位子宮內(nèi)膜組織中存在凋亡并受一些凋亡調(diào)節(jié)基因的調(diào)控，這種現(xiàn)象的存在可能與EM的發(fā)生密切相關(guān)[5]。我們通過檢測(cè)EM患者凋亡調(diào)節(jié)基因Fas、C-myc的表達(dá)水平，探討凋亡調(diào)節(jié)基因Fas、C-myc在EM發(fā)病中的作用，為卵巢EM的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月～2014年12月我院EM患者124例作為對(duì)照組和非EM患者160例作為研究組。所有標(biāo)本來自本院及溫州市人民醫(yī)院病理科存檔的石蠟包埋標(biāo)本，經(jīng)臨床、組織病理學(xué)和免疫組化結(jié)果證實(shí)。根據(jù)存檔的HE切片，選擇無大量出血、無色素的蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片。實(shí)驗(yàn)組為行腹腔鏡下或開腹卵巢囊腫剝除術(shù)，并因月經(jīng)失調(diào)行宮腔鏡診刮術(shù)或因子宮肌瘤行子宮切除術(shù)的患者，經(jīng)病理檢查證實(shí)為卵巢EM，其中處于增生期的異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜與處于分泌期的異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜各62例，平均年齡分別為34.2歲（26～45歲）和35.6歲（25～47歲）。對(duì)照組為同期在本院因子宮肌瘤行子宮切除術(shù)的患者，其中處于增生期的宮內(nèi)膜和處于分泌期的宮內(nèi)膜各80例，平均年齡分別為40.5歲（35～48歲）和42.2歲（37～52歲）。所有患者術(shù)前3個(gè)月均未進(jìn)行激素類藥物治療。

1.2 方法

免疫組化Envision法：所有組織標(biāo)本常規(guī)甲醛固定及石蠟包埋，將蠟塊切成5 μm厚的組織切片，覆蓋于預(yù)先經(jīng)過防脫處理的載玻片上，經(jīng)過烤片、水化、抗原修復(fù)，分別滴加一抗（小鼠抗人Fas、C-myc一抗，上海中山金橋公司）和二抗（兔抗小鼠二抗，上海中山金橋公司），DAB顯色，中性樹膠封片。用公司提供的已知免疫組化結(jié)果陽性的片子作為陽性對(duì)照，用PBS液取代一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

免疫組化的結(jié)果根據(jù)陽性細(xì)胞的百分比和染色的強(qiáng)度進(jìn)行判定[6]，陽性細(xì)胞的比例分為5級(jí)，0分為≤5%，1分為5%～25%，2分為25%～50%，3分為50%～75%，4分為≥75%。染色強(qiáng)度分為4級(jí)，0分為不著色，1分為著色淡，2分為著色中等，3分為著色深。將2個(gè)得分相加，得分≤2分定為陰性，≥3分定為陽性；每張切片隨機(jī)取5個(gè)400倍視野，每個(gè)視野均進(jìn)行陽性細(xì)胞百分比計(jì)分與著色強(qiáng)度記分，該切片的最后得分為5個(gè)視野計(jì)分的平均值；結(jié)果由兩位資深病理醫(yī)師共同判讀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本次研究數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用x2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Fas、C-myc在兩組中的表達(dá)部位

Fas蛋白的陽性部位主要出現(xiàn)在細(xì)胞漿內(nèi)，C-myc蛋白的陽性部位主要在細(xì)胞核內(nèi)。見圖1、2。

2.2 Fas、C-myc在宮內(nèi)膜處于增生期狀態(tài)的陽性表達(dá)結(jié)果（見表1）

圖1 對(duì)照組宮內(nèi)膜Fas的陽性表達(dá)（Envision法，X400）

圖2 EM組異位內(nèi)膜C-myc的陽性表達(dá)（Envision法，X400）

表1 Fas、C-myc在宮內(nèi)膜處于增生期狀態(tài)的陽性表達(dá)結(jié)果 [n（%）]

2.3 Fas、C-myc在宮內(nèi)膜處于分泌期狀態(tài)的陽性表達(dá)結(jié)果（見表2）

表2 Fas、C-myc在宮內(nèi)膜處于分泌期狀態(tài)的陽性表達(dá)結(jié)果 [n（%）]

3 討 論

細(xì)胞凋亡（apoptosis）又稱程序性死亡（programmed cell death，PCD），是指有核細(xì)胞在一定條件下通過啟動(dòng)內(nèi)部機(jī)制經(jīng)過一系列的細(xì)胞變性最終發(fā)生死亡的過程。細(xì)胞凋亡對(duì)生物有機(jī)體的正常生理調(diào)節(jié)、病理發(fā)生及細(xì)胞自身平衡作用已被證實(shí)[7]。研究表明，子宮內(nèi)膜組織中存在促進(jìn)凋亡的基因與抑制凋亡的基因，二者的相互作用在EM的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[8]。

3.1 Fas與子宮內(nèi)膜異位癥

Fas是一種相對(duì)分子質(zhì)量為48000的Ⅰ型跨膜糖蛋白，其屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，為介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要膜表面死亡分子。Fas的配體為FasL。當(dāng)細(xì)胞被激活后，其表面的膜分子FasL與靶細(xì)胞上的Fas相結(jié)合，其后啟動(dòng)凋亡信號(hào)的跨膜傳遞，F(xiàn)as分子胞漿段內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域與Fas死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白相結(jié)合，并激活天門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（caspase）8，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物，進(jìn)而導(dǎo)致caspase 3的激活和一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而啟動(dòng)表達(dá)Fas細(xì)胞的凋亡[9]。有研究表明，正常子宮內(nèi)膜中有Fas的生理性表達(dá)，F(xiàn)as的表達(dá)隨月經(jīng)周期波動(dòng)，增生期無表達(dá)或弱表達(dá)，分泌期表達(dá)逐漸增強(qiáng)。本次研究顯示，對(duì)照組宮內(nèi)膜增生期Fas的表達(dá)率為52.5%，分泌期為71.25%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=5.96，P＜0.05），與文獻(xiàn)報(bào)告一致[10]。實(shí)驗(yàn)組中處于增生期的在位內(nèi)膜為38.71%，異位內(nèi)膜為29.03%；處于分泌期的在位內(nèi)膜為41.94%，異位內(nèi)膜為32.26%。EM患者在位內(nèi)膜與異位內(nèi)膜的不同月經(jīng)周期的x2分別為0.13和0.15，P＞0.05。表明EM患者Fas的表達(dá)不隨月經(jīng)周期而波動(dòng)。Fas的表達(dá)在對(duì)照組內(nèi)膜中與月經(jīng)周期明顯相關(guān)，而EM組中無論是在位內(nèi)膜或異位內(nèi)膜都失去此特征。證明EM患者內(nèi)膜組織中存在Fas表達(dá)紊亂，并且與實(shí)驗(yàn)組中同期宮內(nèi)膜相比表達(dá)率顯著性降低（P＜0.05）。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)告[11]EM患者在位、異位內(nèi)膜中促凋亡基因Fas的凋亡率低，對(duì)凋亡的接受性差，結(jié)果可能造成異位內(nèi)膜不易凋亡，易于生存、種植，形成異位病灶。

3.2 C-myc與子宮內(nèi)膜異位癥

C-myc最初由雞病毒V-myc及其同源物中分離出來[12]，其在哺乳動(dòng)物中的同源對(duì)應(yīng)物為C-myc[13]。C-myc的氨基端（N端）為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，C端包含一個(gè)堿性區(qū)/螺旋-環(huán)-螺旋/亮氨酸拉鏈（bHLHZip）。C-myc編碼bHLHZip家族的轉(zhuǎn)錄因子，可與Max（bHLHZip家族的另一種蛋白質(zhì)）形成二聚體[14]。此二聚體最終可調(diào)控cyclinD1、cyclinE及p27等細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期演進(jìn)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[15]。Johnson等實(shí)驗(yàn)證明EM患者的內(nèi)膜組織C-myc基因有高表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，處于增生期的EM患者在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜C-myc的表達(dá)率分別為30.65% 和59.68%，處于分泌期的EM患者在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜的表達(dá)率分別為27.42%和54.84%，遠(yuǎn)高于同期對(duì)照組宮內(nèi)膜（C-myc表達(dá)率為0%），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2分別為62.92和56.30，P＜0.01），與文獻(xiàn)報(bào)告其本一致[16-17]。根據(jù)研究[15]C-myc可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的功能，同時(shí)C-myc也是一種抑制凋亡的基因，這樣可能有利于異位內(nèi)膜的種殖、生長(zhǎng)。

綜上所述，EM患者內(nèi)膜組織中存在促凋亡基因Fas的低表達(dá)、抑制凋亡基因C-myc的高表達(dá)，在二者的共同作用下，可能使內(nèi)膜組織易于在異位部位生長(zhǎng)、增值。但由于細(xì)胞凋亡的調(diào)控基因較多，究竟哪些基因在EM的發(fā)病中起主要作用，尚需進(jìn)一步研究?？梢栽O(shè)想采用調(diào)節(jié)凋亡的藥物，使異位內(nèi)膜凋亡，病灶縮小，減少其復(fù)發(fā)，也許有一定臨床意義。

參考文獻(xiàn)

[1] O'Down MJ,PhiliPP EE.The history of obstetries and gyneeology [J].NewYork: The Parthenon Publishing GrouP,2000,523.

[2] Laschke MW,Menger MD.In vitro and in vivo approaches to study angiogenesis in the pathophysiology and therapy of endometriosis Hum Reprod Update[J].2007,13(4):331-342.

[3] Garry R.Endometriosis: an invasive disease Gynaecological Endoscopy[J].2001,10(2):79-82.

[4] 于 玲,田永杰.子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病相關(guān)因素的臨床研究[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2013,51(2):79-83.

[5] JIANG QY, WU RJ. Growth mechanisms of endometriotic cells in implanted places: a review[J].Gynecol Endocrinal,2012,28(7): 562-567.

[6] Watanabe H, Kanzaki H,Narukawa S.Bcl-2 and Fas expression in eutopic and ectopic humanendometrium during the menstrual cycle relation to endometrial cell apoptosis[J]. Am J Obstet Gynecol, 1997,176(2):360-368.

[7] Suganuma N, Harada M, Furuhashi M, et al.Apoptosis in humen endometrial and endometriotic tissues[J].Horm Res,1997,48(13): 42.

[8] 徐曉芳,唐 利,李宗恒.細(xì)胞凋亡在子宮內(nèi)膜異位癥中的相關(guān)研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志,2014,16(1):98-101.

[9] MIYAGAWA-HAYASHINO A, TSURUYAMA T, EGAWA H,et al.Fasl expression in hepatic antigen-presenting cells and phagocytosis of apoptotic T cells by FasL.+ Kupffer cells are indicators of rejection activity in human liver allografts[J].Am J Pathol,2007,171(5):1499-1508.

[10] 王 濱,鄭維國,辛?xí)匝?Fas/FasL系統(tǒng)在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)與意義[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2003,34(6):490-492.

[11] 王云霞,李亞里,黃靖香,等.凋亡調(diào)節(jié)基因bcl-2,bax和fas在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2001,1(26):69-71.

[12] Duesberg P H,Vogt P K.Avian acute leukemia viruses MC29 and MH2 share specifi c RNA sequences:evidence for a second class of transforming genes [J].Proc Natl Acad Sci USA,1979,76(4):1633-1637.

[13] Vennstrom B, Sheiness D,Zabielski J, et al. Isolation and characterization of c-myc, a cellular homolog of the oncogene(vmyc)of avian myclocytomatosis virus strain 29[J].J Virol,1982, 42(3):773-779.

[14] Buendia M A,Bourre L,Cairo S.Myc target miRs and liver cancer:small molecules to get Myc sick[J].Gastroenterology, 2012,142(2):214-218.

[15] 程 倩,袁富文,童坦君.從分子水平看C-myc在細(xì)胞衰老中的作用[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2014,41(3):266-272.

[16] Johnson M,Torres M,Alves A,et al.Cell survival in eutopic endometrium from women with endometriosis:expression of c-myc、TGF-beta1 and bax genes[J].Reprot Biol Endocrinol,2005,45-49.

[17] Chiara Pellegrini M.The expression of estrogen receptors as well as GREB1、c-myc and cyclinD1 estrogen-regulated genes implicated in proliferation is increased in peritoneal endometriosis[J].Fertility and Sterility,2012,1200-1208.

本文編輯：孫春宇

【中圖分類號(hào)】R711

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B

【文章編號(hào)】ISSN.2095-8803.2015.12.055.03

基金項(xiàng)目：溫州市醫(yī)藥衛(wèi)生計(jì)劃項(xiàng)目（2015A20）

Expression and signifi cance of Fas and C-myc in ectopic endometrium tissue

HUANG Zhao-lang1, LIN Ke-rong1, WEN Li-hong1, ZHANG Shi-qiang1, ZHANG Pin-nan2
(1. Cangnan County People's Hospital, Zhejiang Wenzhou 325800, China; 2. Wenzhou Municipal People's Hospital, Zhejiang Wenzhou 325000, China)

【Abstract】Objective To explore the roles of apoptosis regulation gene Fas and C-myc in the pathogenesis of endometriosis(EM). Methods Collecting 124 cases of EM patients(Ectopic endometrium and ectopic endometrium in the proliferative phase and in the secretory phase 62 cases each)and 160 cases of non EM patients(endometrium in the proliferative phase and in the secretory phase 80 cases each). Results The expression level of Fas in ectopic and eutopic endometrium in EM was lower than that in non EM group,but the expression level of C-myc was higher than that of non EM group(P＜0.05).Conclusion The differential expression of Fas and C-myc may be closely related to the occurrence and development of EM,which might be expected to provide a new way for the treatment of EM.

【Key words】Fas;C-myc; endometriosis; immunohistochemistry; Envision