李雷激 向蘭 覃綱 祝琳 張迪

CNTF、LIF在腺樣囊性癌的表達及臨床意義

李雷激 向蘭 覃綱 祝琳 張迪

目的 檢測睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（ciliary neurotrophic factors,CNTF），白血病抑制因子（leukemia inhibitor factor,LIF）在腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)組織中的表達，探討CNTF、LIF在ACC發(fā)生發(fā)展及嗜神經(jīng)侵襲(perineural invasion，PNI)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征間的關(guān)系。方法 采用免疫組化Envision法對CNTF、LIF在60例ACC組織及20例癌旁正常組織中的表達進行檢測，結(jié)合患者臨床病理資料，分析它們的表達與患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系。結(jié)果 CNTF、LIF在癌旁正常組織中低表達，在ACC組織中呈高表達，CNTF在不同病理類型及T分期，是否有嗜神經(jīng)侵襲、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），LIF在是否有嗜神經(jīng)侵襲、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），CNTF、LIF在ACC中的表達呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論 CNTF、LIF與ACC的發(fā)生相關(guān)，并且與ACC的惡性進展關(guān)系密切，可作為判斷ACC預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。

睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子；白血病抑制因子；腺樣囊性癌

腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)是好發(fā)于口腔頜面部大小涎腺的惡性程度較高的腫瘤，約占頭頸腫瘤的2%～4%，涎腺惡性腫瘤的15%～25%[1]。該腫瘤起病隱匿，生長緩慢，常無麻木疼痛等自覺癥狀，瘤體無包膜，它有神經(jīng)侵犯、易復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移傾向較強、對放化療均不敏感的生物學(xué)特性，給臨床治療和判斷預(yù)后帶來了較大困難。ACC的發(fā)生發(fā)展及特殊的生物學(xué)特性與多因素有關(guān)，其形成機制還不十分明確。本研究采用免疫組化Envision法對CNTF、LIF在60例ACC組織及20例癌旁正常組織中的表達進行檢測，并對這些患者的臨床病理資料進行統(tǒng)計學(xué)分析，探討CNTF、LIF在ACC中的表達及與其他侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因素之間的聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2004年1月～2009年1月瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的病理診斷明確、臨床資料完整的頭頸部ACC患者腫瘤組織標(biāo)本60例，男23例，女37例，年齡23～73歲，中位年齡55歲。按2005年WHO涎腺腫瘤組織病理學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，對60例ACC進行病理分類，其中腺管型47例，實體型13例。根據(jù)術(shù)中所見以及術(shù)后病理檢查所示的腫瘤的浸潤程度，按照UICC(2002)頭頸部腫瘤TNM分期標(biāo)準(zhǔn)對60例標(biāo)本進行T分期，其中T119例、T215例、T313例、T413例，將T1、T2期列為早期組，T3、T4期列為晚期組。依據(jù)患者臨床表現(xiàn)有無疼痛、麻木、面癱等神經(jīng)癥狀及鏡下觀察到的腫瘤細(xì)胞包繞神經(jīng)或有神經(jīng)束浸潤劃分為有、無神經(jīng)侵襲癥狀組，有嗜神經(jīng)侵襲組19例，無嗜神經(jīng)侵襲組41例。依據(jù)患者術(shù)后情況，劃分為術(shù)后有、無復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移組，有復(fù)發(fā)組13例，無復(fù)發(fā)47例，有轉(zhuǎn)移12例，無轉(zhuǎn)移48例。

1.2 主要試劑 CNTF、LIF多克隆抗體購自博奧森生物試劑公司，Envision二抗購自丹麥DAKO公司，DAB顯色試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法 以20例癌旁正常組織作正常對照，用已知陽性切片作陽性對照，PBS液代替一抗作陰性對照與實驗組切片在同條件下進行免疫組化染色。具體步驟嚴(yán)格按照說明書進行。

1.4 結(jié)果判斷 采用德國萊卡病理圖像采集系統(tǒng)進行圖像采集，CNTF、LIF的陽性反應(yīng)定位以胞質(zhì)或胞膜著色呈棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，使用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對CNTF、LIF表達情況進行半定量分析，測定每個視野下陽性反應(yīng)面積(Sum Area)、累積光密度(Sum IOD)，計算每張照片中陽性反應(yīng)區(qū)域的平均光密度（MOD=Sum IOD/Sum Area），取5張照片MOD的平均值作為該例標(biāo)本CNTF、LIF表達的相對量，切片陽性區(qū)表達的強弱與光密度值呈正相關(guān)，光密度值大則陽性表達強，反之亦然。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS17.0 for windows進行統(tǒng)計學(xué)分析，各組MOD值用“x±s”表示，經(jīng)正態(tài)性檢驗確定符合正態(tài)分布后分別對不同組間CNTF、LIF表達MOD值比較應(yīng)用兩獨立樣本的t檢驗（方差齊），t’檢驗（方差不齊）；兩指標(biāo)間的相關(guān)性分析應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析法進行分析；以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，當(dāng)P＜0.05為差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CNTF在ACC組織中的表達 CNTF蛋白主要定位于腫瘤細(xì)胞胞漿及部分胞膜，極少胞核上也可見陽性表達，在正常涎腺組織中腺泡細(xì)胞無陽性表達，陽性染色顆粒相對低表達于導(dǎo)管上皮細(xì)胞。見圖1、圖2。ACC組織中CNTF表達的MOD值為(0.0740±0.0398)；正常組織組中的值為（0.0139±0.0064），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.700，P=0.000），CNTF在ACC的表達明顯強于癌旁正常組織。實體型組織表達的MOD值為（0.1052±0.0404），腺管型表達的MOD值為

（0.0654±0.0357），實性型染色強度高于腺管型者(P＜0.05)。有PNI的ACC組織中CNTF表達MOD值（0.0932±0.0423），無PNI的ACC組織中表達值為（0.0651±0.0357），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.668，P=0.01）。見圖3、圖4。CNTF在有PNI組織的表達強于無PNI組織。有無轉(zhuǎn)移ACC組織CNTF表達的MOD值分別為（0.0962±0.0344）、（0.0685±0.0394），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.231，P=0.030)；CNTF在有轉(zhuǎn)移的組織中的表達較無轉(zhuǎn)移組織強。見圖5、圖6。T1-2、T3-4的MOD值分別為（0.0625±0.0389）、（0.0890±0.0364），有無復(fù)發(fā)的ACC組織MOD值分別為（0.0944±0.0398）、（0.0684±0.0383），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

圖1 癌旁正常組織中CNTF僅在腺管上皮胞漿著色（400×）Fig.1 Expression of CNTF in normal tissue near the ACC,the gland epithelium staining only

圖2 ACC中CNTF彌漫性陽性表達（400×）Fig.2 CNTF expression were prevalent in ACC tissues

圖3 PNI 組織中CNTF強陽性表達（400×）Fig.3 Higher expression of CNTF in ACC with PNI

圖4 無PNI組織中CNTF弱陽性表達，(400×）Fig.4 Lower expression of CNTF in ACC without PNI

圖5 轉(zhuǎn)移ACC組織中CNTF陽性表達（400×）Fig.5 Higher expression of CNTF in ACC with metastasis

圖6 無轉(zhuǎn)移ACC組織中CNTF弱陽性表達（400×）Fig.6 Lower expression of CNTF in ACC without metastasis

2.2 LIF在ACC組織中的表達 LIF在癌旁正常組織中的表達呈陰性或者弱陽性，在ACC組織中LIF彌散分布在腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)及部分胞膜。見圖7、圖8。ACC組織中LIF表達的MOD值為(0.0415±0.0202)；正常組織組中的MOD值為(0.0102±0.0053)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t'=10.935，P=0.000），LIF在ACC組織中表達強于正常組織，實體型和腺管型中MOD值為（0.0431±0.0216）、（0.0411±0.0200），有PNI的組織中LIF表達MOD值為（0.0512±0.0198），無PNI的ACC組織中LIF表達MOD值為（0.0370±0.0190），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.654，P=0.01）。見圖9、圖10。LIF在有PNI組織中的表達強于無PNI組織，轉(zhuǎn)移與否的LIF表達也存在顯著差異。見圖11、圖12。在轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移的ACC組織中MOD值分別為（0.0533±0.0181）、（0.0386±0.0198），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.350，P=0.022），LIF在有轉(zhuǎn)移的組織的表達強于無轉(zhuǎn)移組織，T1-2、T3-4的MOD值為（0.0399±0.0201）、（0.0436±0.0206），差異無統(tǒng)計學(xué)意義，有無復(fù)發(fā)的MOD值為（0.0581±0.0182）、（0.0369±0.0184），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表1 CNTF的表達的MOD值及統(tǒng)計情況（x±s）

圖7 癌旁正常組織中LIF幾乎不表達或僅在腺管上皮輕度著色（400×）Fig.7 LIF is rarely expressed in normal tissue near the ACC or only be expressed in the gland epithelium softly

圖8 ACC中LIF彌漫性陽性表達于癌細(xì)胞胞漿（400×）Fig.8 LIF expression were prevalent in ACC tissues，cytoplasm and staining

圖9 PNI組織中LIF陽性表達（400×）Fig.9 Higher expression of LIF inACC with PNI

圖10 無PNI組織中LIF弱陽性表達(400×）Fig.10 Lower expression of LIF in ACC without PNI

2.3 CNTF、LIF在ACC表達的相關(guān)性分析 對CNTF與LIF的表達值作Pearson相關(guān)分析（r=0.703，P=0.000），CNTF與LIF在ACC表達的MOD值呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

圖11 轉(zhuǎn)移ACC組織中LIF陽性表達（400×）Fig.11 Higher expression of LIF in ACC with metastasis

圖12 無轉(zhuǎn)移ACC組織中LIF弱陽性表達（400×）Fig.12 Lower expression of LIF in ACC without metastasis

表2 LIF的表達的MOD值及統(tǒng)計情況

3 討論

ACC是一類惡性程度較高的腫瘤，早期多以無痛性光滑的圓形或結(jié)節(jié)狀包塊為表現(xiàn)，邊界不清，活動差，患者可長時間帶瘤生存，可數(shù)月、數(shù)年甚至數(shù)十年，當(dāng)出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移或者PNI時可出現(xiàn)疼痛麻木等表現(xiàn)[2]。它的發(fā)生與惡性進展與相關(guān)的細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子、細(xì)胞因子等多因素有關(guān)。

在ACC及其PNI的發(fā)生過程中，神經(jīng)組織和腫瘤細(xì)胞之間的相互影響、相互吸引具有重要意義，它們的相互作用需要作為非神經(jīng)源性腫瘤和神經(jīng)組織之間的橋梁[3]——神經(jīng)營養(yǎng)因子家族（neurotrophic factors,NTFs）的作用。CNTF是NTFs的一員，最初是從雞胚眼球脈絡(luò)膜、睫狀體和虹膜，隨后自成年大鼠及兔坐骨神經(jīng)中分離提取的分子量為20～40kD的酸性蛋白質(zhì)[4-5]，具有多種生物活性，不僅能促進多種神經(jīng)元的存活，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、分化和損傷修復(fù)中具有重要意義[6]，還參與腫瘤生長和分化的調(diào)控[7-9]。

胡欣等研究CNTF以及CNTFR系統(tǒng)對于肝癌細(xì)胞增殖方面的影響，并通過實驗發(fā)現(xiàn)CNTF能夠在細(xì)胞周期方面發(fā)揮作用，能夠幫助細(xì)胞從細(xì)胞周期的G2／M期阻滯中恢復(fù)過來，對肝癌細(xì)胞的增殖起到正向促進作用。有學(xué)者指出當(dāng)神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)受到破壞、神經(jīng)元被激活時，可刺激大量存在于外周神經(jīng)雪旺細(xì)胞中的CNTF釋放進入細(xì)胞間隙，經(jīng)軸突逆向轉(zhuǎn)運到胞體單獨起作用或與組織中存在的可溶性CNTF受體形成復(fù)合物等多種方式而發(fā)揮促進神經(jīng)損傷修復(fù)的作用[10]。本實驗觀察到CNTF在ACC癌細(xì)胞中呈陽性表達，在分化程度較低的實體型、有PNI、轉(zhuǎn)移組的表達顯著高于分化程度相對較高的腺管型、無PNI及轉(zhuǎn)移組，有復(fù)發(fā)、T分期晚期的組織中CNTF表達顯著高于無復(fù)發(fā)及T分期早期的組織，即ACC惡性程度越高CNTF表達越高，由此可以初步推測通過檢測CNTF的表達對ACC患者的惡性程度進行評估，進一步制定合理的治療方案。

LIF是一種能使M1白血病細(xì)胞系向正常細(xì)胞分化的細(xì)胞因子，是一種分泌性蛋白，由細(xì)胞在胞漿內(nèi)合成并分泌至細(xì)胞外而發(fā)揮其生物學(xué)作用。作為IL-6細(xì)胞因子超家族中的一種多效性細(xì)胞因子，可在多種組織和細(xì)胞表達且作用于不同細(xì)胞而發(fā)揮多種生物學(xué)作用，廣泛調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖和分化[11]。研究發(fā)現(xiàn)，LIF可通過觸發(fā)Jak／Stat3信號通路中Stat3活化，調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)幕蚋淖円鸬湫偷哪[瘤干細(xì)胞行為，經(jīng)mTORC1/ p70S6K信號途徑抑制基因凋亡，促進癌細(xì)胞增值等方式促進絨毛膜上皮癌、黑色素瘤，鼻咽癌的增殖生長[12-14]，卻通過LIF/ JAK/STAT途徑使細(xì)胞周期被抑止在G0/G1期，從而有效抑制細(xì)胞分化增殖，抑制宮頸癌病毒原癌基因的表達在甲狀腺髓樣癌、宮頸癌的增殖生長顯示出抑制作用[15-16]，而有關(guān)LIF在ACC發(fā)生發(fā)展中的作用卻少有研究。本研究通過免疫組化法檢測了LIF在頭頸部ACC中的表達，發(fā)現(xiàn)LIF在ACC中的表達增高，在有PNI、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的ACC組織中的表達顯著高于無PNI、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的組織，因而推測LIF在頭頸ACC發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮促進作用，如果研究出抑制LIF的表達的方法，便可能對阻止ACC的惡性進展及侵襲轉(zhuǎn)移起重要作用。另外，本研究還表明，在ACC組織中CNTF與LIF表達呈正相關(guān)，提示二者在ACC的發(fā)生發(fā)展中具有協(xié)同作用，具體機制有待進一步研究。

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Objective To detect the expression of Ciliary neurotrophic factors（CNTF）and leukemia inhibitor factor（LIF) in adenoid cystic carcinoma (ACC) tissues and normal tissues near the ACC, then investigate their relevance with oncogenesis and development of the ACC and with its clinical pathological features such as perineural invasion(PNI) and metastasis. Methods Immunohistochemistry Envision method was employed to detected the expression of CNTF and LIF in the 60 ACC tissues and 20 normal tissues near the ACC. Combined with patients’ clinical information, the relationship between the CNTF and LIF expression and clinicopathological parameter was analyzed. Results CNTF and LIF were lower expressed in normal tissues while over expressed in ACC tissues.There were significant difference of CNTF expression in different pathological classification, T stage, and in the cases whether they had PNI, recurrence and metastasis or not, while there were significant difference of LIF expression in specimens whether in PNI, recurrence and metastasis or not .The expression of CNTF and LIF in the tissues of ACC was positive related. Conclusion CNTF and LIF expression are related with ACC oncogenesis and development, and they were closely associated with ACC’s malignant progress. We expect that they may provide effective biological evidence for diagnosing and treating ACC.

Ciliary neurotrophic factors; Leukemia inhibitor factor; Adenoid cystic carcinoma

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.23.001

四川 646000 瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 （李雷激向蘭 覃綱 祝琳 張迪）

李雷激 E-mail:lileiji0301@163.com