沈　偉，張一文，李赫宇（.山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，山東煙臺(tái)6499；.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津300457）

大川芎方HPLC指紋圖譜方法學(xué)研究

沈偉1，張一文1，李赫宇2
（1.山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，山東煙臺(tái)264199；2.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津300457）

摘要：建立大川芎方HPLC指紋圖譜方法學(xué)?？疾焐V條件，選擇合適的分析波長(zhǎng)，考察方法的精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性等。結(jié)果表明：色譜條件：色譜柱：Hypersil ODS2 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）反相色譜柱，流動(dòng)相甲醇-1%醋酸梯度洗脫：0 min→35 min，A：5%→35%；35 min→50 min，A：35%→80%；50 min→60 min，A：80%→80%；60 min→65 min，A：80%→5%；柱溫：30℃；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。在上述條件下，所建立方法的精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性等良好。所建立的大川芎方HPLC指紋圖譜方法學(xué)為該方的定性、定量分析提供了新方法。

關(guān)鍵詞：大川芎方；高效液相色譜；指紋圖譜

大川芎方源于金·劉完素《宣明論方》，由川芎、天麻兩味藥組成。川芎，又名大川芎，為傘形科多年生草本植物川芎的根莖，為四川特產(chǎn)藥材，性味辛溫，有活血行氣，祛風(fēng)止痛之功，諸多月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、頭痛等的藥膳中多用川芎。天麻具有對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)、抗驚厥、鎮(zhèn)靜催眠等作用[1]，同時(shí)亦具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與保健功效，在民間有很多種做法，常用于保健食療[2]。川芎、天麻配合使用，即可作為治療偏頭痛的經(jīng)典中藥復(fù)方，同時(shí)又是制備保健食品的常用配對(duì)原料[3]。由于方中川芎和天麻所含化學(xué)成分分子結(jié)構(gòu)、極性等差異較大，在目前的文獻(xiàn)報(bào)道中，一般需分別建立定性、定量分析方法。本文建立了大川芎方的HPLC指紋圖譜分析方法，能簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行定性、定量分析，為該方與相應(yīng)保健食品的質(zhì)量控制提供了有效手段。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

洋川芎內(nèi)酯 I對(duì)照品（批號(hào)：140226，純度HPLC≥98%）：成都克洛瑪生物科技有限公司；阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)773-9001）：中國(guó)藥品生物制品檢定所；天麻素對(duì)照品（批號(hào)110807-200205）：中國(guó)藥品生物制品檢定所；川芎藥材經(jīng)山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中藥鑒定教研室張欽德教授鑒定為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖：購(gòu)于上海泰坤堂中醫(yī)院（產(chǎn)地云南，批號(hào)20121028）；天麻藥材經(jīng)山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中藥鑒定教研室張欽德教授鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia elata B1.的干燥塊莖：購(gòu)于上海泰坤堂中醫(yī)院（產(chǎn)地云南，批號(hào)20121028）。

甲醇：色譜級(jí)，美國(guó)天地（TEDIA）試劑公司；其余試劑為分析純。

1.2儀器

SHIMADZU高效液相色譜儀（LC-2010A HT），配備DAD二極管陣列檢測(cè)器、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、LC-solution色譜工作站；TU-1900紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1色譜條件

色譜柱：HypersilODS2C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-1%醋酸，按表1程序梯度洗脫；柱溫：30℃；流速：1 mL/min。

表1　流動(dòng)相梯度洗脫變化程序Table 1　The gradient elution procedure

1.3.2供試品溶液的制備

1.3.2.1川芎效應(yīng)組分的制備方法

川芎粗粉，分別加12倍量、10倍量、8倍量70%乙醇，回流提取3次（1.5、1、0.5 h），濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，真空干燥，得川芎效應(yīng)組分干浸膏。

1.3.2.2天麻效應(yīng)組分的制備方法

天麻粗粉，加10倍量70%乙醇，回流提取2次，每次1 h，過濾，合并濾液，減壓回收乙醇，真空干燥，得天麻效應(yīng)組分干浸膏。

1.3.2.3大川芎方供試品溶液的制備方法

稱取川芎、天麻干浸膏（生藥量4∶1）于25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超聲溶解10 min，經(jīng)0.45 μm有機(jī)相微孔濾膜濾過，即得60 mg/mL的大川芎方供試品溶液。

1.3.2.4阿魏酸對(duì)照品溶液的制備方法

精密稱取FA對(duì)照品4.6 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得46 μg/mL的FA對(duì)照品溶液。

1.3.2.5天麻素對(duì)照品溶液的制備方法

精密稱取GS對(duì)照品3.0 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得30 μg/mL的GS對(duì)照品溶液。

1.3.2.6洋川芎內(nèi)酯I對(duì)照品溶液的制備方法

精密稱取SI對(duì)照品14.8 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得1.48 mg/mL的SI對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取1 mL儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得14.8 μg/mL的SI對(duì)照品溶液。

2　結(jié)果與分析

2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

精密量取川芎、天麻效應(yīng)組分干浸膏，分別置100 mL容量瓶中，另取100 mL容量瓶，按川芎、天麻生藥量4∶1的比例稱取干浸膏，均加甲醇稀釋至刻度，超聲溶解。精密吸取一定量的川芎效應(yīng)組分溶液、天麻效應(yīng)組分溶液和大川芎方效應(yīng)組分溶液，轉(zhuǎn)移置100 mL容量瓶中，制成0.4 mg/mL的川芎供試品、1.0 mg/mL的天麻供試品和3.0 mg/mL的大川芎方供試品，以甲醇為空白，在200 nm～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果見圖1。

圖1　全波長(zhǎng)掃描圖Fig.1　Full-wavelength scan diagram

根據(jù)紫外掃描結(jié)果可知，川芎效應(yīng)組分在280 nm 和320 nm波長(zhǎng)下均有較穩(wěn)定的吸收。天麻效應(yīng)組分在270 nm波長(zhǎng)下有較穩(wěn)定的吸收。大川芎方效應(yīng)組分在280 nm波長(zhǎng)下有較穩(wěn)定的吸收。

本試驗(yàn)重點(diǎn)考查了大川芎方效應(yīng)組分270、280、320 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下的色譜圖，見圖2。

圖2　大川芎方HPLC圖譜Fig.2　HPLC fingerprint diagram of Dachuanxiong formula

結(jié)果表明：270 nm色譜圖各色譜峰的響應(yīng)值較高，出峰數(shù)目多，故檢測(cè)波長(zhǎng)定為270 nm。

2.2參照物的選擇

FA對(duì)照品、GS對(duì)照品、SI對(duì)照品的色譜圖見圖3。

圖3　對(duì)照品色譜圖Fig.3　Chromatogram of three reference substances

其中保留時(shí)間為31.1 min的FA色譜峰（見圖3，3號(hào)峰）是HPLC圖譜中峰面積較大、出峰時(shí)間適中且很穩(wěn)定的色譜峰，選擇該峰作為參照。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1精密度試驗(yàn)

取同一批次大川芎方效應(yīng)組分干浸膏，制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定。結(jié)果：各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD<5%，表明儀器精密度良好。

2.3.2重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批次大川芎方效應(yīng)組分干浸膏，平行制備6份供試品溶液，測(cè)定。結(jié)果：各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD<5%，表明方法重現(xiàn)性良好。2.3.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次大川芎方效應(yīng)組分干浸膏，制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12 h進(jìn)樣分析，測(cè)定。結(jié)果：各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD<5%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4指紋圖譜的測(cè)定及結(jié)果

制備10批川芎、天麻效應(yīng)組分干浸膏，并按供試品溶液制備方法平行制備10份供試品溶液，測(cè)定HPLC色譜圖，記錄65 min的色譜圖譜，結(jié)果見圖4。

圖4　大川芎方效應(yīng)組分10批樣品指紋圖譜Fig.4　HPLC fingerprints of 10 batch samples of Dachuanxiong formula effective extracts

經(jīng)與圖3對(duì)照品色譜圖比較得知，1號(hào)峰為GS峰，3號(hào)峰為FA峰，6號(hào)峰為SI峰。以FA色譜峰的保留時(shí)間和峰面積的積分值為1，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積比，其值RSD<5%。結(jié)果表明，所建立的指紋圖譜分析方法有較好的重現(xiàn)性及穩(wěn)定性，可用于大川芎方的定性、定量分析。

3　討論

以往的大川芎方研究者常以其中的一到兩種主要成分（FA、GS）作為研究指標(biāo)，但川芎、天麻所含化學(xué)成分較為復(fù)雜，僅以一到兩種成分為指標(biāo)進(jìn)行研究顯然無法體現(xiàn)該方的整體作用特點(diǎn)，故建立大川芎方化學(xué)成分的指紋圖譜是十分必要的。本文所建立的大川芎方效應(yīng)組分HPLC指紋圖譜測(cè)定方法，方法學(xué)研究表明所建立的方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便易行，色譜圖中色譜峰最為豐富，能相對(duì)全面的反映出大川芎方中所含的復(fù)雜化學(xué)成分體系，不僅可以用于大川芎方、大川芎方制劑或川芎、天麻藥對(duì)藥膳、保健食品物質(zhì)基礎(chǔ)的探究，也可以為該方及相應(yīng)保健食品的質(zhì)量控制提供強(qiáng)有力的技術(shù)手段。

參考文獻(xiàn)：

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[3]L Wang,J Zhang,Y Hong,et al.Phytochemical and Pharmacological Review of Da Chuanxiong Formula:A Famous Herb Pair Composed of Chuanxiong Rhizoma and Gastrodiae Rhizoma for Headache[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:42,53,69

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.041

收稿日期：2015-07-02

作者簡(jiǎn)介：沈偉（1982—），男（漢），講師，碩士，研究方向：中藥化學(xué)與中藥炮制學(xué)。

The HPLC Fingerprint Analysis of Dachuanxiong Formula

SHEN Wei1，ZHANG Yi-wen1，LI He-yu2
（1.Shandong College of Traditional Chinese Medicine，Yantai 264199，Shandong，China；2.Tianjin Ubasichealth Nutrition Co.Ltd.，Tianjin 300457，China）

Abstract：To develop HPLC chromatographic fingerprint for Dachuanxiong formula.The chromatographic conditions were investigated，the proper analytical wavelength was inspected，and theprecision，reproducibility and stability were determined.Chromatographic conditions：A Hypersil ODS2 C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）was applied with the gradient elution solvent system composing of methanol（A）and 1%acetic acid water（B）：0 min→35 min，A：5%→35%；35 min→50 min，A：35%→80%；50 min→60 min，A：80%→80%；60 min→65 min，A：80%→5%.The column temperature was 30℃and the flow rate was 1 mL/min.The signal was acquired at 270 nm.Under the conditions we investigated，the precision，reproducibility and stability of the HPLC chromatographic fingerprint method were good.The HPLC chromatographic fingerprint method established in this paper applied a new method for qualitative and quantitative for Dachuanxiong formula.

Key words：Dachuanxiong formula；HPLC；fingerprint