李翠芳，趙凌艷，肖 麗

(十堰市太和醫(yī)院 附屬湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北 十堰442000)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)是一類(lèi)原因不明好發(fā)于四肢關(guān)節(jié)、心臟等器官的自身免疫性疾病，臨床病理改變以四肢關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主，常累及關(guān)節(jié)軟骨滑膜及骨質(zhì)［1］。其病因主要為軟骨的破壞與變性，是軟骨分解與合成代謝失衡的結(jié)果［2］，此類(lèi)疾病多發(fā)于中年以后的慢性、退行性關(guān)節(jié)疾病，膝關(guān)節(jié)腔多伴有大量積液為多見(jiàn)，臨床以四肢(膝關(guān)節(jié)為甚)疼痛、變形和活動(dòng)受限為特點(diǎn)。臨床特征為關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的炎癥和腫脹、慢性進(jìn)行性病程，并可致多個(gè)關(guān)節(jié)完全強(qiáng)直，骨質(zhì)疏松及關(guān)節(jié)畸形，并最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能的喪失，目前尚無(wú)理想的治療方法。中醫(yī)認(rèn)為膝骨性關(guān)節(jié)炎屬“痹證”，“風(fēng)、寒、濕”合而成痹，此類(lèi)患者常挾濕氣下注于關(guān)節(jié)［3］。由于軟骨分解及合成代謝失衡及筋絡(luò)脈隧痹阻不通，多繼發(fā)滑膜與滑液炎，其病理改變多以膝關(guān)節(jié)滑膜受損及關(guān)節(jié)腔積液為主［4］，本實(shí)驗(yàn)電針配合穴位注射骨瓜提取物注射液治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，旨在挖掘祖國(guó)中醫(yī)藥治療關(guān)節(jié)炎優(yōu)勢(shì)，探討其作用機(jī)制，以期研究聯(lián)合治療的鎮(zhèn)痛消炎作用機(jī)制，為臨床提供安全可靠的治療膝骨關(guān)節(jié)炎合并關(guān)節(jié)腔積液治療方案。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

日本大耳白兔40 只，體質(zhì)量(2500 ±50)g，雌雄兼用，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(鄂)2011-0008;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證:SYXK(鄂)2011-0031。采用隨機(jī)數(shù)字表編號(hào)，隨機(jī)分為模型組、電針組、骨瓜提取物組及聯(lián)合治療組，每組10 只。

1.2 儀器設(shè)備及試劑

骨瓜提取物注射液(哈爾濱圣泰生物制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H23023507);小牛軟骨Ⅱ型膠原加福氏完全佐劑(上海實(shí)生細(xì)胞生物技術(shù)有限公司)。SDZ-II 型電子針療儀(上海坤弘，型號(hào):SDZ-II)。

1.3 類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型制備

動(dòng)物造模時(shí)先剃掉兔膝關(guān)節(jié)及以下毛發(fā)，碘伏消毒，采用日本鬼頭康彥［5］膝骨關(guān)節(jié)炎造摸法，將小牛軟骨Ⅱ型膠原加福氏完全佐劑0.1 mL 于第1、3、7 天注入右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，根據(jù)臨床上超疲勞容易提前出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎的發(fā)病特點(diǎn)，每日強(qiáng)迫動(dòng)物活動(dòng)30 min，14 天后出現(xiàn)以下與臨床急性膝關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)一致的癥狀即可確定大鼠急性膝關(guān)節(jié)炎模型造模成功:①關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅、腫、熱、痛、同時(shí)軟組織腫脹或積液;②關(guān)節(jié)及其周?chē)┯病⒒顒?dòng)受限;③發(fā)病的部位常見(jiàn)于膝、髖、踝等關(guān)節(jié)處;④關(guān)節(jié)病理切片鏡檢出現(xiàn)關(guān)節(jié)腔大量滲出液，軟骨表面粗糙，滑膜粘連、增生、肥厚等膝關(guān)節(jié)炎臨床病理學(xué)改變;⑤關(guān)節(jié)積液檢查出現(xiàn)HA 降低、PGE2、IL-1β含量明顯升高。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒β蕿?00%。

1.4 治療方法

術(shù)后14 天造模成功后，分別將兔固定于兔固定器，電針組以電針齊刺為主的針灸治療方法治療，取足血海、三里、陽(yáng)陵泉為主穴用一次性無(wú)菌針灸針齊刺，旁開(kāi)1 寸兩旁各刺1 針，其針尖與正中1 針的針尖匯合，刺入骨膜，行導(dǎo)氣手法，使針感向膝周擴(kuò)散為佳;以齊刺點(diǎn)為正極，配穴為負(fù)極，接SDZ- II 型電子針療儀，連續(xù)波，頻率10 Hz，留針30 min。骨瓜提取物組肌肉注射骨瓜提取物1 mg/d/kg。聯(lián)合治療組取足三里、血海、陽(yáng)陵泉3 穴為主穴電針刺激30 min 后穴位注射骨瓜提取物。模型組注射生理鹽水。以上各組均治療1 日1 次，連續(xù)治療14 天。

1.5 檢驗(yàn)指標(biāo)及檢測(cè)方法

參照文獻(xiàn)［6］，于治療前后分別病理檢查測(cè)定關(guān)節(jié)滑膜BMPs 及MMP-1 陽(yáng)性表達(dá)率(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%)，抽取兔膝關(guān)節(jié)腔積液，測(cè)定積液IL-8、PGE2、HA 含量。

1.6 膝關(guān)節(jié)腫脹百分率的測(cè)定

采用玻璃容器排水法測(cè)量造模前及治療14 天后容積并計(jì)算左膝關(guān)節(jié)腫脹百分率。方法為:先取100 ml量筒注入蒸餾水，液面與量筒最高處平齊，用50 ml注射器吸取量筒內(nèi)蒸餾水約30 ml。于每只兔左膝關(guān)節(jié)縫矢狀面用記號(hào)筆做一標(biāo)記，然后把兔左足緩慢伸人量筒內(nèi)，使標(biāo)記與量筒最高處平齊。再用已吸入30 ml水的注射器向量筒內(nèi)緩慢注入蒸餾水并使液面再次與最高處及兔膝關(guān)節(jié)標(biāo)記處一致，讀取注射器內(nèi)剩余液體體積，再用30 ml-注射器內(nèi)剩余液體體積即為兔的左膝關(guān)節(jié)容積，重復(fù)3 次取平均值。左膝關(guān)節(jié)腫脹百分率(%)=(造模后容積-造模前容積)/造模前容積×100%。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 治療前后兩組HA、IL-1β、PGE2比較

見(jiàn)表1，在經(jīng)14 天治療后，模型組IL-1β、PGE2明顯升高，HA 降低，說(shuō)明炎癥反應(yīng)持續(xù)存在，造模成功;電針組HA 升高、IL-1β 降低，但PGE2無(wú)明顯變化;骨瓜提取物組HA 升高，IL-1β、PGE2含量明顯下降，與模型組及電針組比較(P ＜0.05)，差異顯著;聯(lián)合治療組HA 明顯升高，IL-1β、PGE2含量明顯下降，與電針組及骨瓜提取物組比較(P ＜0.05)，差異顯著。提示:聯(lián)合治療組在經(jīng)電針齊刺后穴位注射骨瓜提取物可明顯降低IL-1β、PGE2、促進(jìn)HA 分泌。

2.2 治療前后BMPs、軟骨細(xì)胞MMP-1 陽(yáng)性表達(dá)比較

模型組BMPs 在經(jīng)14 天治療后無(wú)明顯變化，軟骨細(xì)胞MMP-1 陽(yáng)性表達(dá)明顯升高。電針組BMPs 有升高趨勢(shì)，軟骨細(xì)胞MMP-1 陽(yáng)性表達(dá)則無(wú)明顯變化，與治療前比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。骨瓜提取物組BMPs 明顯升高，軟骨細(xì)胞MMP-1 陽(yáng)性表達(dá)率降低，與模型組及電針組比較(P ＜0.05)，差異顯著。聯(lián)合治療組在經(jīng)電針齊刺后穴位注射骨瓜提取物，BMPs 較骨瓜提取物組升高更明顯，軟骨細(xì)胞MMP-1 陽(yáng)性表達(dá)率進(jìn)一步降低，與電針組及骨瓜提取物組比較(P ＜0.05)，差異顯著，見(jiàn)表2。

2.3 治療前后各組動(dòng)物足腫脹度、消腫時(shí)間比較

見(jiàn)表3，電針組足腫脹度、消腫時(shí)間均有一定的降低，與模型組及本組治療前比較，P ＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。骨瓜提取物組腫脹度、消腫時(shí)間較電針組明顯縮短，與模型組及電針組比較，P ＜0.05。聯(lián)合治療組則明顯優(yōu)于電針組及骨瓜提取物組，P ＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 治療前后兩組HA、IL-1β、PGE2比較 (±s，n=10)

表1 治療前后兩組HA、IL-1β、PGE2比較 (±s，n=10)

注:與治療前比較，△P ＜0.05;與模型組比較，▲P ＜0.05;與電針組比較，#P ＜0.05;與骨瓜提取物組比較，* P ＜0.05。

組別HA(μg/L)IL-1β(pg/ml)PGE2(OD)治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后模型組 1.39 ±0.20 0.93 ±0.12△ 34.24 ±4.50 50.57 ±6.11△ 0. 92 ±0.09 1.87 ±0.28△電針組 1.43 ±0.21 3.85 ±0.56△▲ 35.29 ±4.33 21.38 ±2.97△▲ 0. 90 ±2.87 0.86 ±0.05骨瓜提取物組 1.40 ±0.19 4.79 ±0.71▲# 34.47 ±4.06 22.29 ±2.83▲# 0. 93 ±0.09 0.57 ±0.06▲#聯(lián)合治療組 1.42 ±0.22 6.79 ±0.84#* 36.21 ±4.41 14.36 ±2.45#* 0. 91 ±0.08 0.19 ±0.02#*

表2 治療前后各組動(dòng)物BMPs、MMP-1 比較(±s，n=10)

表2 治療前后各組動(dòng)物BMPs、MMP-1 比較(±s，n=10)

注:與治療前比較，△P ＜0.05;與模型組比較，▲P ＜0.05;與電針組比較，#P ＜0.05;與骨瓜提取物組比較，* P ＜0.05。

組別BMPs(ng/L)MMP-1(%)治療前 治療后 治療前 治療后模型組7.08±0.73 7.31±0.67 21.01±3.35 29.91±4.01電針組 6. 87±0.61 7.92±0.54 21.93±3.23 19.34±2.41骨瓜提取物組 7.14±0.65 10.62±0.79▲# 20.97±3.17 13.37±2.22▲#聯(lián)合治療組 7.03±0.57 13.43±1.94#* 22.01±3.41 8.97±1.04#*

表3 治療前后各組動(dòng)物足腫脹度、消腫時(shí)間比較(±s，n=10)

表3 治療前后各組動(dòng)物足腫脹度、消腫時(shí)間比較(±s，n=10)

注:與治療前比較，△P ＜0.05;與模型組比較，▲P ＜0.05;與電針組比較，#P ＜0.05;與骨瓜提取物組比較，* P ＜0.05。

組別 足腫脹度(%)消腫時(shí)間(天)治療前 治療后 治療前 治療后模型組 35.92±3.78 39.21±4.02 14.21±2.31 13.57±1.95電針組 34.41±3.23 28.34±3.05△▲13.29±2.51 10.31±2.41△▲骨瓜提取物組36.29±3.52 21.39±2.42▲#14.41±2.27 8.34±1.42▲#聯(lián)合治療組 35.54±3.23 10.30±1.49#* 13.02±2.10 6.33±1.09#*

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，當(dāng)膝關(guān)節(jié)因外傷或其他原因受損傷后，局部關(guān)節(jié)血瘀氣滯，濕濁之氣痹阻于膝，治則當(dāng)針灸以舒筋通絡(luò)、行氣止痛，中藥活血化瘀、利濕除痹而達(dá)到臨床治愈的目的［7］。類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎以四肢特別膝關(guān)節(jié)伴關(guān)節(jié)積液多見(jiàn)，其病理改變以關(guān)節(jié)腔及滑膜炎性浸潤(rùn)，造成關(guān)節(jié)面軟骨被破壞、變性并繼發(fā)滑液炎癥，是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分解與合成代謝紊亂造成的慢性、退行性關(guān)節(jié)疾?。?］。臨床上多發(fā)于35 歲以上的中年人，臨床以膝關(guān)節(jié)疼痛、變形和活動(dòng)受限為主要特點(diǎn)，目前治療辦法多以抗炎消腫為主，但療效并不理想［9］。

HA 是關(guān)節(jié)滑液和軟骨基質(zhì)的重要組成部分，主要為由N-乙酰氨基葡萄糖胺二糖和D-葡萄糖醛酸有規(guī)律重復(fù)構(gòu)成的大分子鏈狀多糖，HA 可抑制類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎時(shí)關(guān)節(jié)腔內(nèi)IL-1β 及PGE2等炎性介質(zhì)的合成及擴(kuò)散，降低滑膜的通透性，減少關(guān)節(jié)腔內(nèi)滲液滲出［10］。IL-1β、PGE2是機(jī)體的主要炎癥因子，正常情況關(guān)節(jié)中可檢出微量IL-1β、PGE2，在患類(lèi)風(fēng)濕性疾病時(shí)，IL-1β 及PGE2含量則會(huì)異常增高。正常關(guān)節(jié)滑液和軟骨中BMPs 分化較高，MMP-1 細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)極低。故本實(shí)驗(yàn)研究采用電針配合穴位注射骨瓜提取物治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，以HA、IL-1β、PGE2、BMPs 及MMP-1 細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率為主要生化指標(biāo)來(lái)衡量該治療方案的療效。

實(shí)驗(yàn)中選用日本大耳白兔血海、足三里、陽(yáng)陵泉3穴，是因?yàn)殛?yáng)陵泉可強(qiáng)筋祛濕，主治膝痹;足三里具有養(yǎng)血益氣之功效，主治下肢痿痹;而血海穴主活血，與陽(yáng)陵泉及足三里配伍具有舒筋活絡(luò)、利通關(guān)節(jié)之效［11］。結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組兔在經(jīng)過(guò)14 天電針血海、足三里、陽(yáng)陵泉后，PGE2、MMP-1 細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率、足腫脹度及消腫時(shí)間均有不同程度的降低和縮短，這可能與電針刺激可激發(fā)經(jīng)氣、促進(jìn)局部血液循環(huán)及局部病變組織新陳代謝、降低痛閾、減輕關(guān)節(jié)滑膜表面神經(jīng)神經(jīng)末梢對(duì)炎性因子IL-1β、PGE2刺激的反應(yīng)敏感度有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與周效思等［12］研究威靈仙能明顯延長(zhǎng)小鼠熱板痛閾時(shí)間和顯著減少小鼠扭體反應(yīng)的次數(shù)相吻合。聯(lián)合治療組兔在配合外敷威靈仙浸膏，HA 較單用電針刺激及威靈仙外敷增高明顯，IL-1β、PGE2及MMP-1 進(jìn)一步降低，這可能是威靈仙浸膏外敷后通過(guò)皮膚吸收，促使滑膜內(nèi)襯B 型滑膜細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞大量分泌HA，以達(dá)到潤(rùn)滑關(guān)節(jié)、延緩軟骨退變及保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用。同時(shí)，中藥吸收后還可抑制機(jī)體產(chǎn)生過(guò)多的IL- lB 及PGE2等炎癥因子，降低滑膜的通透性及因炎癥刺激而造成MMP-1細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，這對(duì)減輕IL-1β 及PGE2等對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的破壞、減少關(guān)節(jié)內(nèi)滲出液及炎性反應(yīng)起到至關(guān)重要的作用。

由于骨瓜提取物注射液中富含多種游離氨基酸，為成骨細(xì)胞合成BMPs、TGF-β 等骨源性生物因子提供能量和原料，促進(jìn)骨源性生物因子的合成。實(shí)驗(yàn)證實(shí)骨瓜提取物注射液中的多肽類(lèi)骨代謝因子增加BMPs 的合成，抑制MMP-1 過(guò)度表達(dá)。本研究認(rèn)為其促進(jìn)BMPs 的合成的主要藥理作用是促進(jìn)成骨細(xì)胞有絲分裂及趨化作用［13］。BMPs 作為一種骨誘導(dǎo)因子，是間充質(zhì)細(xì)胞向骨系細(xì)胞轉(zhuǎn)化的信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì)，具有誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的作用。同時(shí)，BMPs 還可通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β 和FGF 而誘導(dǎo)新骨形成，從而促進(jìn)鈣、磷代謝，增加骨鈣沉積，防治和改善骨質(zhì)疏松的發(fā)生［14］。骨瓜提取物注射液中的甜瓜籽提取物能降低關(guān)節(jié)局部毛細(xì)血管通透性，減少I(mǎi)L- 1β 合成及炎性滲出，降低因炎癥刺激而造成MMP-1 細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，促進(jìn)局部炎癥及組織粘連時(shí)血運(yùn)障礙的恢復(fù)，改善關(guān)節(jié)局部的血液循環(huán)。總之，骨瓜提取物注射液通過(guò)調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)積液中HA 及IL-1β含量、滑膜BMPs 及MMP-1 陽(yáng)性表達(dá)，影響關(guān)節(jié)及骨代謝，刺激成骨細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)鈣、磷代謝，增加鈣沉積，防治骨質(zhì)疏松［15］，縮短消腫時(shí)間，清除關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎性因子而起到活血化瘀、祛風(fēng)除濕、消腫抗炎鎮(zhèn)痛的目的，改善關(guān)節(jié)腔內(nèi)環(huán)境而達(dá)“通則不痛”的功效［16］。

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