王 嬰，伍艷芬

（廣東藥學(xué)院醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東中山528458）

響應(yīng)面法優(yōu)化葛根素提取工藝的研究

王 嬰，伍艷芬

（廣東藥學(xué)院醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東中山528458）

目的優(yōu)化葛根的提取工藝參數(shù)，提高葛根素的提取率。方法在單因素初篩的基礎(chǔ)上，以HPLC測(cè)定的葛根素含量為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并利用Design Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到響應(yīng)面數(shù)據(jù)并分析結(jié)果。結(jié)果乙醇濃度與提取時(shí)間、提取時(shí)間與料液比、乙醇濃度與料液比之間均存在著交互作用。葛根素的最優(yōu)提取條件為乙醇濃度78%，提取時(shí)間為143 min，料液比為1∶10。結(jié)論優(yōu)化的工藝提取條件簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性良好，適用于葛根素的提取。

葛根素；中藥制藥工藝；工藝學(xué)；多元分析；乙醇

葛根為豆科植物野葛的干燥根，具有解肌退熱、生津止渴、通經(jīng)活絡(luò)等功效，用于治療感冒發(fā)熱、熱痢、眩暈、頭痛等癥[1]。葛根中含有的異黃酮類成分具有降低心肌耗氧量、促進(jìn)冠狀動(dòng)脈循環(huán)、緩解心絞痛等多種藥理活性[2-4]。其中葛根素為主要有效成分，目前已有注射劑、片劑、膠囊等劑型上市，并成為臨床治療心腦血管病的一線用藥[5-6]。為提高葛根素的產(chǎn)率，本研究采用響應(yīng)面法對(duì)葛根素的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 2489高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；

C18 ODS色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；KQ3200超聲波清洗器（東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司）；SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；FA2204B電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；TC-15恒溫水浴鍋（海寧市華星儀器廠）。

1.1.2 藥物與試劑 葛根素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110752-200511）；甲醇（色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；95%乙醇為分析純；水為雙蒸水；中藥葛根購(gòu)于廣州致信藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥資源系曾令杰教授鑒定為豆科植物野葛的干燥根。

1.2 方法

1.2.1 葛根素含量測(cè)定方法的建立

1.2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水（32∶68）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm；柱溫為室溫；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；理論板數(shù)按葛根素計(jì)算應(yīng)不低于3 000[7-8]。

1.2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取葛根素對(duì)照品10.0 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1.0 mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取葛根最粗粉15 g，按響應(yīng)面設(shè)計(jì)1號(hào)提取方案，按料液比1∶10加入80%乙醇，加熱回流2次，每次120 min，趁熱濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮至適量，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加80%乙醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

1.2.1.4 樣品測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品與供試品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄圖譜。

1.2.1.5 線性關(guān)系考察 精密吸取葛根素對(duì)照品溶液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，葛根素質(zhì)量濃度X（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程。

1.2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，得葛根素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）。

1.2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取葛根最粗粉15 g，共取6份，按1.2.1.3項(xiàng)下方法分別制成供試品溶液。精密吸取20μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算含量的RSD。

1.2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于配制后0、2、4、6、8 h內(nèi)，在1.2.1.1項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，得葛根素峰面積的RSD。

1.2.1.9 回收率試驗(yàn) 精密吸取已知葛根素含量的供試品溶液6份，每份1mL，每份加入質(zhì)量濃度為0.02mg/mL的對(duì)照品溶液3 mL，混勻后，精密吸取20 μL，在色譜條件下測(cè)定，得平均回收率及RSD。

1.2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken原理，以葛根素含量為響應(yīng)值，對(duì)乙醇濃度、料液比及提取時(shí)間進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以確定葛根素提取的最佳工藝參數(shù)[9]。見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表

1.2.3 模型擬合與響應(yīng)面優(yōu)化 通過(guò)Design Expert 7.0.0軟件處理數(shù)據(jù)后，將響應(yīng)值與各個(gè)因素進(jìn)行回歸擬合，得回歸方程后，分別對(duì)其一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)進(jìn)行方差分析，得出優(yōu)選提取條件，并進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，以考察響應(yīng)面結(jié)果的可靠性。

2 結(jié) 果

2.1 葛根HPLC色譜圖 HPLC圖譜顯示，葛根素峰形尖銳，與其他成分分離情況良好。見圖1。

圖1 葛根HPLC色譜圖

2.2 線性關(guān)系考察 回歸方程為Y=9.7×107X-2.6×105，r=0.999 5，表明葛根素質(zhì)量濃度在0.02～0.20 mg/mL線性關(guān)系良好。

2.3 精密度試驗(yàn) 葛根素峰面積的RSD為0.39%，表明儀器精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 葛根素含量的RSD為1.06%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 葛根素峰面積的RSD為1.02%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 回收率試驗(yàn) 平均回收率為98.54%，RSD為0.86%，表明本法具有良好的準(zhǔn)確度。見表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7 模型擬合與響應(yīng)面優(yōu)化 回歸方程為Y=2.92+ 0.36A+0.34B+0.33C+0.14AB+0.18AC-0.062BC-0.11A2-0.27B2-0.052C2（R2=0.986 9），方程因變量與自變量之間呈良好的線性關(guān)系（P＜0.01），表明該模型可以用于實(shí)際值的預(yù)測(cè)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表3。乙醇濃度與提取時(shí)間的交互項(xiàng)、乙醇濃度與料液比、提取時(shí)間與料液比的交互項(xiàng)對(duì)葛根素含量有顯著影響。葛根素的最優(yōu)提取工藝條件是：乙醇濃度為78%，提取時(shí)間為143 min，料液比為1∶10，葛根素的最大含量預(yù)測(cè)值為4.522 mg。3批驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，葛根素平均含量為4.493%，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差小于1%，表明該模型與實(shí)際情況擬合良好，模型可靠。葛根素提取交互作用的三維曲面圖見圖2。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

圖2 葛根素提取交互作用的三維曲面圖

3 討 論

在預(yù)試驗(yàn)中，對(duì)提取次數(shù)、乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比對(duì)葛根素含量的影響進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，提取2次以上明顯優(yōu)于1次，而提取2次和3次沒有明顯區(qū)別，故提取次數(shù)確定為2次；乙醇濃度考察了50%、60%、70%、80%、90%，提取時(shí)間考察了30、60、90、120、150 min，料液比考察了1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12。結(jié)果表明，乙醇濃度在70%～90%、提取時(shí)間在90～150 min、料液在1∶8～1∶12內(nèi)明顯變化，由此確定了響應(yīng)面法的取值范圍。

近年來(lái)，響應(yīng)面法逐漸應(yīng)用于中藥提取工藝的優(yōu)化中，其最大優(yōu)點(diǎn)在于可在充分減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)的同時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行條件的細(xì)化，而不像正交試驗(yàn)?zāi)菢又荒軓脑O(shè)定的水平中選點(diǎn)[10-12]。本文在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以葛根素含量作為指標(biāo)，采用Box-Behnken原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立了乙醇加熱回流法提取葛根素的擬合方程，篩選出葛根素的最優(yōu)提取工藝，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使提取工藝更加科學(xué)合理，為實(shí)際生產(chǎn)工藝的優(yōu)化提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：312-313.

[2]楚紀(jì)明，馬樹運(yùn)，李海峰，等.HPLC同時(shí)測(cè)定不同種葛根中3種異黃酮成分的含量[J].食品與藥品，2015，17（1）：50-53.

[3]鞏紅巖，秦元旭，王更富，等.葛根素對(duì)大鼠體外循環(huán)后心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及抗氧化應(yīng)激機(jī)制的探討[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（1）：165-167.

[4]眭榮燕，王萬(wàn)輝，連磊凡，等.染料木素對(duì)Iso致心肌肥厚大鼠的抗氧化及抑制炎癥反應(yīng)作用研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（19）：175-178.

[5]何正光，陳剛，?；埒P，等.葛根素注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27（8）：1181-1182.

[6]李佳，江培.葛根素的研究進(jìn)展[J].黑龍江醫(yī)藥，2014，27（1）：61-64.

[7]劉計(jì)權(quán)，宋強(qiáng)，楊文珍，等.HPLC法測(cè)定不同生長(zhǎng)年限的葛根不同部位中葛根素的含量[J].中國(guó)藥房，2015，26（3）：366-368.

[8]李曉娟.反相高效液相色譜法測(cè)定護(hù)肝膠囊中葛根素含量[J].中國(guó)藥業(yè)，2014，23（23）：53-55.

[9]陳家儀，賈薇，曾元兒，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化枳實(shí)黃酮類成分的提取工藝[J].藥物分析雜志，2012，32（7）：1267-1271.

[10]吳秋月，陳鵬，仲月明，等.響應(yīng)面法優(yōu)化提取銀杏雄株葉片聚戊烯醇的工藝研究[J].中成藥，2013，35（2）：267-272.

[11]馬瑞麗，張蓉，徐秀泉，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化大血藤中總酚的超聲提取工藝[J].中成藥，2013，35（2）：404-407.

[12]劉偉，孫維峰，吳新榮，等.響應(yīng)面法在優(yōu)化中藥提取工藝中的應(yīng)用[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014，32（8）：1960-1962.

Study on response surface method for optimizing puerarin extraction process

Wang Ying，Wu Yanfen
（School of Pharmaceutical and Chemical Engineering，Guangdong Pharmaceutical University，Zhongshan，Guangdong 528458，China）

ObjectiveTo optimize the extraction technological parameters of Radix Puerariae in order to improve the extraction ratio of puerarin.MethodsBased on the single factor preliminary screening，with the puerarin content detected by HPLC as the response value，the three-factor and three-level Box-Behnken test design was carried on.The experimental data were analyzed by using the Design-Expert software.ResultsThe interaction action existed between the ethanol concentration and extraction time，between the extraction time and solid-liquid ratio and between the ethanol concentration and solid-liquid ratio.The optimal extraction conditions of puerarin were the ethanol concentration of 78%，the extraction time of 143 min and the solid to liquid ratio of 1∶10.ConclusionThe optimized technological extraction conditions are simple with good reproducibility and suitable for the extraction of puerarin.

Puerarin；Pharmaceutical technology；Technology；Multivariate analysis；Ethanol

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.16.007

A

1009-5519（2015）16-2426-03

2015-05-01）

王嬰（1978-），女，江西南昌人，實(shí)驗(yàn)師，主要從事藥物新劑型與質(zhì)量控制研究工作；E-mail：yyxm799@126.com。