趙艷，趙頌，李晴，方超，張龍，楊菁Δ

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院 科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，遼寧 錦州 121001；2.遼寧醫(yī)學(xué)院 遼寧省心腦血管藥物基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121001)

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肌肽對谷氨酸誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

趙艷1，趙頌1，李晴2，方超2，張龍2，楊菁2Δ

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院 科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，遼寧 錦州 121001；2.遼寧醫(yī)學(xué)院 遼寧省心腦血管藥物基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121001)

目的 探討肌肽對谷氨酸所致人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株(SH-SY5Y)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 用谷氨酸建立SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化；用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測定細(xì)胞存活率；Hoechst33258染色觀察細(xì)胞核形態(tài)的變化；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況；熒光探針CDFH-DA法檢測細(xì)胞中活性氧(ROS)的水平。結(jié)果 與正常組相比較，谷氨酸組的細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)，熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞核固縮裂解等凋亡改變，細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞中ROS水平明顯升高(P<0.01)；與谷氨酸組相比較，0.6、3、15 mmol/L肌肽保護(hù)組細(xì)胞存活率明顯提高，細(xì)胞核的凋亡改變有明顯改善，細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞中ROS水平明顯降低(P<0.01)；單純肌肽組的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞存活率及細(xì)胞凋亡率與正常組相比無明顯變化，細(xì)胞中ROS水平比正常組略低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 肌肽對谷氨酸所致的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抗氧化作用有關(guān)。

谷氨酸; 肌肽; SH-SY5Y細(xì)胞; 細(xì)胞凋亡

谷氨酸是哺乳動物腦內(nèi)最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，谷氨酸常常大量釋放并堆積，通過興奮性毒性和氧化毒性等作用對神經(jīng)細(xì)胞造成明顯的損傷，從而引起各種神經(jīng)退行性病變[1]。

肌肽是一種含組氨酸的二肽，在肌肉和腦組織中高表達(dá)，在生物體內(nèi)具有多種生理活性作用，包括維持酸堿平衡、抗氧化作用、螯合劑、以及神經(jīng)調(diào)節(jié)作用等[2]。肌肽作為一種內(nèi)源性的抗氧化劑，它具有水溶性好、性質(zhì)穩(wěn)定、分子量小和易于被機(jī)體利用等優(yōu)點(diǎn)[3]。本課題組研究表明，肌肽對大鼠腦片缺氧缺糖/再灌損傷具有保護(hù)作用[4]。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步用SH-SY5Y細(xì)胞為研究對象，用谷氨酸誘導(dǎo)建立損傷模型，探討肌肽對谷氨酸損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制，為肌肽臨床用藥提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：SH-SY5Y細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；肌肽、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、L-谷氨酰胺、二甲基亞砜(DMSO)及四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium ，MTT)均購于Sigma公司；Annexin V-FITC購自北京四正柏生物科技有限公司；Hoechst33258、活性氧檢測試劑盒、多聚甲醛購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器：美國BD公司流式細(xì)胞儀FACS Calibur；Thermo Scientific HERAcell 240i細(xì)胞培養(yǎng)箱；日本Olympus公司倒置顯微鏡和熒光顯微鏡；BioTekSynergyz全自動酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞置于含10%熱滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，放于 37 ℃、 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3～4 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組：細(xì)胞分為正常組、谷氨酸組、單純肌肽組、0.6、3、15 mmol/L肌肽保護(hù)組。正常組加入新鮮培養(yǎng)基，谷氨酸組加入終濃度為20 mmol/L的谷氨酸[5]，單純肌肽組加入終濃度為15 mmol/L的肌肽，肌肽保護(hù)組分別加入終濃度為0.6、3、15 mmol/L的肌肽，培養(yǎng)1 h后再加入終濃度為20 mmol/L的谷氨酸，均繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后檢測各指標(biāo)。

1.2.3 檢測指標(biāo)

① 觀察SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)變化：各組細(xì)胞分別于倒置顯微鏡下觀察形態(tài)并拍照。

② 細(xì)胞存活率的檢測：各組細(xì)胞每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL ，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞楓，搖床上避光振蕩10 min。在全自動酶標(biāo)儀490 nm處測定光密度(A)值。

細(xì)胞存活率%=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對照組A值)/(正常組A值-空白對照組A值)×100%。

③ Hoechst33258熒光染色法觀測細(xì)胞核形態(tài)變化： 用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min，PBS洗1次，然后用Hoechst33258(50 mg/L)染色，37 ℃避光孵育20 min，PBS洗3次，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)。

④ 細(xì)胞凋亡檢測：用Annexin V和PI雙染試劑盒檢測細(xì)胞凋亡情況。收集細(xì)胞，用PBS洗2次，棄去上清，加入 5 μL Annexin V(10 mg/L)避光孵育10 min，再加入10 μL PI(20 mg/L)，避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，采用cell-quest軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行獲取和分析。

⑤ 細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測：收集各組細(xì)胞[6]，將細(xì)胞重懸于DCFH-DA終濃度為10 μM的無血清培養(yǎng)基中，輕輕吹打均勻后避光孵育20 min，以無血清培養(yǎng)基充分洗滌細(xì)胞3次后，使用酶標(biāo)儀在488 nm激發(fā)波長和525 nm發(fā)射波長下檢測熒光強(qiáng)度。ROS水平(%)=實(shí)驗(yàn)組FI/對照組FI×100%[7]。

2 結(jié)果

2.1 肌肽對谷氨酸損傷細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 正常組細(xì)胞多呈梭形、多邊形生長，細(xì)胞間連接緊湊，周邊有突起，細(xì)胞透光性好；谷氨酸組細(xì)胞密度顯著降低，部分細(xì)胞軸突回縮，細(xì)胞形態(tài)變圓、皺縮，細(xì)胞間連接松散，透光率降低；0.6、3、15 mmol/L肌肽保護(hù)組細(xì)胞密度較谷氨酸組明顯增加，皺縮現(xiàn)象減輕，胞體突起增多，細(xì)胞間連接恢復(fù)緊密，細(xì)胞透光率提高，其中15 mmol/L肌肽保護(hù)組細(xì)胞形態(tài)改善最為明顯；單純肌肽組與正常組細(xì)胞比較細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下觀察SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的變化(×200)A:正常組; B:谷氨酸組; C:0.6 mmol/L肌肽保護(hù)組; D:3.0 mmol/L肌肽保護(hù)組; E:15.0 mmol/L肌肽保護(hù)組; F:單純肌肽組Fig.1 Morphological changes of SH-SY5Ycells observed by inverted-microscope(×200)A: Control group; B: Glutamate group; C: 0.6 mmol/L carnosine protection group; D: 3.0 mmol/L carnosine protection group; E: 15.0 mmol/L carnosine protection group; F:Simple carnosine group

2.2 肌肽對谷氨酸損傷的細(xì)胞存活率影響 與正常組相比，谷氨酸組的細(xì)胞存活率明顯降低，達(dá)到(59.30±4.00)%(P<0.01)，而0.6、3.0、15.0 mmol/L肌肽保護(hù)組細(xì)胞的細(xì)胞存活率較谷氨酸組明顯提高，分別為(65.8±3.70)%、(74.80 ±2.60)%和(80.50±3.40)%(P<0.01)，其中15.0 mmol/L肌肽保護(hù)組細(xì)胞的細(xì)胞存活率最高。見表1。

組別細(xì)胞存活率(λ=490nm)正常組1.000±0.030##谷氨酸組0.593±0.040**0.6mmol/L肌肽保護(hù)組0.658±0.037**##3.0mmol/L肌肽保護(hù)組0.748±0.026**##15.0mmol/L肌肽保護(hù)組0.805±0.034**##單純肌肽組1.000±0.034##

**P<0.01，與正常組比較，compared with normal control group；##P<0.01，與谷氨酸組比較，compared with glutamate group

2.3 肌肽對細(xì)胞核形態(tài)的影響 正常組細(xì)胞可見細(xì)胞核染色均勻，細(xì)胞核圓形或橢圓形。谷氨酸組可觀察到細(xì)胞核變形、核固縮，甚至細(xì)胞核裂解(箭頭所示)。0.6、3、15 mmol/L肌肽保護(hù)組細(xì)胞核形態(tài)明顯改善，核變形固縮減少。單純肌肽組與正常組比較細(xì)胞核形態(tài)無明顯變化。見圖2。

圖2 熒光顯微鏡檢測SH-SY5Y細(xì)胞核的形態(tài)變化A:正常組; B:谷氨酸組; C:0.6 mmol/L肌肽保護(hù)組; D:3.0 mmol/L肌肽保護(hù)組; E:15.0 mmol/L肌肽保護(hù)組; F:單純肌肽組Fig.2 Morphological changes of SH-SY5Y cells nucleus under fluorescent microscopeA: Control group; B: Glutamate group; C: 0.6 mmol/L carnosine protection group; D: 3.0 mmol/L carnosine protection group; E: 15.0 mmol/L carnosine protection group; F:Simple carnosine group

2.4 肌肽對谷氨酸引起的細(xì)胞凋亡的影響 與正常組相比較，谷氨酸組細(xì)胞凋亡率明顯升高，與谷氨酸組相比較，0.6、3.0、15.0 mmol/L肌肽保護(hù)組細(xì)胞凋亡率均有所降低，且隨著肌肽濃度的增高凋亡率下降更為明顯。單純肌肽組與正常組相比無明顯變化(見圖3)。

圖3 肌肽對谷氨酸誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率的影響A:正常組; B:谷氨酸組; C:0.6 mmol/L肌肽保護(hù)組; D:3.0 mmol/L肌肽保護(hù)組; E:15.0 mmol/L肌肽保護(hù)組; F:單純肌肽組Fig.3 Effects of carnosine on apoptosis rate of glutamate injured SH-SY5Y cellA: Control group; B: Glutamate group; C: 0.6 mmol/L carnosine protection group; D: 3.0 mmol/L carnosine protection group; E: 15.0 mmol/L carnosine protection group; F:Simple carnosine group

2.5 肌肽對ROS水平的影響 與正常組相比較，谷氨酸組ROS水平明顯增高；0.6、3.0、15.0 mmol/L肌肽保護(hù)組細(xì)胞的ROS水平與谷氨酸組比較均有一定程度的降低，且隨著肌肽濃度的增高ROS水平降低更為明顯(P<0.05)，單純肌肽組與正常組比較略有降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

組別ROS水平(%)正常組100±10 谷氨酸組188±19**0.6mmol/L肌肽保護(hù)組174±7**#3.0mmol/L肌肽保護(hù)組159±10**##15.0mmol/L肌肽保護(hù)組137±10**##單純肌肽組91±11##

**P<0.01，與正常組比較，compared with normal control group；#P<0.05，##P<0.01，與谷氨酸組比較，compared with glutamate group

3 討論

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞系是一種分化程度較低的腫瘤細(xì)胞。該細(xì)胞繁殖快，細(xì)胞形態(tài)、生理和生化功能與正常神經(jīng)細(xì)胞相似，已被廣泛用于神經(jīng)分泌模型的建立和神經(jīng)元損傷機(jī)制的研究[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，谷氨酸組細(xì)胞凋亡率明顯升高，細(xì)胞核呈現(xiàn)明顯的凋亡特征，說明20 mmol/L谷氨酸可以引起細(xì)胞凋亡。而0.6、3.0、15.0 mmol/L肌肽保護(hù)組細(xì)胞的存活率比谷氨酸組大大提高，細(xì)胞核形態(tài)明顯改善，凋亡率顯著減少，說明不同濃度的肌肽對谷氨酸誘導(dǎo)的凋亡具有保護(hù)作用。

谷氨酸除通過激活谷氨酸受體產(chǎn)生興奮性毒性引起DNA的氧化損傷外，還可通過抑制細(xì)胞膜上谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能而產(chǎn)生氧化毒性作用，該作用以細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽耗竭和ROS成分升高為主要特征[9]。ROS過多堆積，引起不同程度的細(xì)胞毒性反應(yīng)，如膜脂質(zhì)、DNA氧化損傷和蛋白質(zhì)的表達(dá)異常等，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，谷氨酸組ROS的含量明顯升高，而0.6、3.0、15.0 mmol/L肌肽保護(hù)組細(xì)胞的ROS水平明顯降低。有文獻(xiàn)報(bào)道，肌肽具有的抗氧化作用，可以抑制由鐵、銅、肌紅蛋白和脂肪氧化酶引起的脂肪氧化反應(yīng)，還能與大多數(shù)自由基相互作用，從而調(diào)節(jié)ROS的含量[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

綜上所述，肌肽能夠抑制谷氨酸引起的細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能與其阻止興奮性和氧化性毒性級聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)一步發(fā)展，從而抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生相關(guān)。

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(編校：譚玲)

Protective effect of carnosine on Glutamate induced apoptosis in SH-SY5Y cells

ZHAO Yan1, ZHAO Song1, LI Qing2, FANG Chao2, ZHANG Long2, YANG Jing2Δ

(1. Scientific Experimental Center, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China; 2. Provincial Key Laboratory of Cardiovascular and Cerebrovascular Drug Basic Research, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of carnosine on Glutamate induced apoptosis in SH-SY5Y cells and its mechanism.MethodsThe injury model was established by treating SH-SY5Y cells with glutamate in vitro. Inverted microscope was used to observe cell morphology. The cell viability was detected by MTT assay, and changes in nucleus were detected by Hoechst33258 staining under fluorescence microscopy. The cell apoptosis rates were measured by flow cytometry. The reactive oxygen species (ROS) level in cells was detected by fluorescent probe CDFH-DA. Results Compared with normal control group, the cell viability in glutamate group decreased (P<0.01), the morphology changes of cell apoptosis such as karyopyknosis and split were observed by Hoechst33258 staining, while the apoptosis rate and the level of ROS were increased (P<0.01). Compared with glutamate group, the cell viability of carnosine 0.6,3,15 mmol/L groups obviously increased(P<0.01), while the morphology changes of cell apoptosis significantly improved, the apoptosis rate and the level of ROS were obviously reduced (P<0.01). Compared with normal control group, the cell viability, the morphology changes and the apoptosis rate did not significantly change in carnosine group. The level of ROS was reduced, but there was no statistically significant difference between two groups. ConclusionCarnosine has apparent protective effect on apoptosis of SH-SY5Y cells injury induced by glutamate. The mechanism may be related to carnosine prevent the occurrence of oxidative stress.

glutamate; carnosine; SH-SY5Y cells; apoptosis

遼寧省科技項(xiàng)目(2013225305)；遼寧醫(yī)學(xué)院“校長基金”奧鴻博澤基金醫(yī)藥創(chuàng)新基金(XZJJ20130103-01)

趙艷，女，碩士，研究方向：生化藥物，E-mail:zhaoyan73@163.com; 楊菁，通信作者，博士后，教授，研究方向: 神經(jīng)生物學(xué)及相關(guān)藥物，E-mail:lnmuyangjing@126.com。

R963,R971

A

1005-1678(2015)12-0029-04