柳傳毅，陳彥潔，方瓊彤，呂滿霞，吳新榮

(1.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2. 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科，廣州市老年慢病患者合理用藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510010)

肌肽是主要由β-丙氨酸和L-組氨酸組成的內(nèi)源性二肽，目前的研究證實(shí),肌肽具有清除自由基、抗氧化活性，藥理活性廣泛。因肌肽具有高效的藥理活性和低毒的特征，研究者認(rèn)為，其可以為阿爾茨海默癥、腦卒中等疾病的治療提供新的方向。Holliday等[6]在MRC-5成纖維細(xì)胞和HeLa細(xì)胞模型上，研究得出20～50 mmol·L-1的肌肽并不影響正常二倍體人成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，但是能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。目前尚未完全得出PD發(fā)病機(jī)制，但已被證實(shí)的機(jī)制有氧化應(yīng)激、清除自由基等。Boldyrev等[7]報(bào)道，肌肽能夠明顯改善PD神經(jīng)癥狀，并能提高血紅細(xì)胞中Cu/Zn-超氧化物歧化酶的活性。研究報(bào)道，肌肽對(duì)臨床上的多種抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的毒副作用具有保護(hù)作用。Noori等[8]實(shí)驗(yàn)證實(shí)，肌肽能夠有效抑制由順鉑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致的超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物水平的降低。綜上所述，肌肽主要是通過(guò)清除自由基、抗氧化應(yīng)激等機(jī)制發(fā)揮作用，由此可得出肌肽是一種極具有潛在治療PD的藥物。本研究以SH-SY5Y細(xì)胞作為模型，研究L-肌肽是否通過(guò)抗氧化應(yīng)激作用，來(lái)降低由魚(yú)藤素誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，進(jìn)而探究魚(yú)藤素的神經(jīng)毒性。

1 材料

1.1細(xì)胞株人神經(jīng)瘤細(xì)胞株 SH-SY5Y，由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科提供。

1.2試劑魚(yú)藤素(deguelin，批號(hào)：045M4736V，HPLC級(jí))、L-肌肽(批號(hào)：BCBQ8925V)、二甲基亞砜(批號(hào)：RNBD6895)、Accutase solution(細(xì)胞消化液，批號(hào)：SLBN5790V)，均購(gòu)自Sigma公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：C1065-2)、活性氧檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：S0033-1)，均購(gòu)自碧云天公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)：20151225；CCK-8試劑，日本同仁公司，批號(hào)：JU739；RPMI 1640培養(yǎng)基，Gibco公司，批號(hào)：8116053；吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙染試劑盒，索萊寶公司，批號(hào)：20160111。

1.3儀器二氧化碳培養(yǎng)箱、Multiscan-GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；YSK-319型倒置顯微鏡、IX7型倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；YSK-239型低溫高速離心機(jī)(Sigma公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Millipore公司)。

2 方法

2.1藥物的配制

2.1.1魚(yú)藤素的配制 1 mmol·L-1魚(yú)藤素母液配制：在6.3 mL的DMSO溶液中溶解2.5 g魚(yú)藤素，并在-20 ℃條件下避光保存，不同溶度的魚(yú)藤素用培養(yǎng)基稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.1.2L-肌肽的配制 將L-肌肽加入到不同體積的培養(yǎng)基中，配制成實(shí)驗(yàn)所需濃度，并用無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。

5.實(shí)驗(yàn)環(huán)境。在檢驗(yàn)過(guò)程中環(huán)境溫度控制不到位，使得溫度增加變化較大，會(huì)影響到檢驗(yàn)儀器設(shè)備、試劑的正常運(yùn)行和工作，使得儀器的精準(zhǔn)度發(fā)生變化，繼而影響到食品檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)從細(xì)胞庫(kù)中取出SH-SY5Y細(xì)胞，快速解凍并在超凈臺(tái)上將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，加入適量已配好的新鮮培養(yǎng)基，離心，取下沉液，后加入新鮮的培養(yǎng)基,培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的恒溫箱中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞密度為5×107·L-1，每孔接種細(xì)胞100 μL后，放入5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁。

2.3.1L-肌肽對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響 次日加藥前，去除舊的培養(yǎng)基，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，其中實(shí)驗(yàn)組每孔100 μL，加入不同濃度的L-肌肽(1、10、20、40、60、80、100 mmol·L-1)，其中空白組無(wú)細(xì)胞，只有培養(yǎng)基，對(duì)照組只加相同培養(yǎng)基。加藥后，96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.3.2L-肌肽對(duì)魚(yú)藤素抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖作用的影響 次日加藥前，去除舊的培養(yǎng)基，后加入100 μL不同濃度的藥物，其中實(shí)驗(yàn)組加入情況如下：A組：8 μmol·L-1魚(yú)藤素；B組：8 μmol·L-1魚(yú)藤素+3 mmol·L-1L-肌肽；C組：8 μmol·L-1魚(yú)藤素+30 mmol·L-1L-肌肽；D組：20 μmol·L-1魚(yú)藤素；E組：20 μmol·L-1魚(yú)藤素+3 mmol·L-1L-肌肽；F組：20 μmol·L-1魚(yú)藤素+30 mmol·L-1L-肌肽；G組：50 μmol·L-1魚(yú)藤素；H組：50 μmol·L-1魚(yú)藤素+3 mmol·L-1L-肌肽；I組：50 μmol·L-1魚(yú)藤素+30 mmol·L-1L-肌肽，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組只加培養(yǎng)基，空白組無(wú)細(xì)胞，只加培養(yǎng)基。加藥后，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，除去舊培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基與CCK-8試劑按照9 ∶1的比例配制成混合溶液后，每孔加入100 μL混合液，培養(yǎng)板繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，避光反應(yīng)2 h，在450 nm波長(zhǎng)處，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。細(xì)胞存活率/%=[(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)]×100%。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。

2.4AO/EB法檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)和凋亡情況取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種在6孔板中，每孔接種3 mL密度為5×107·L-1，均勻分布。在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁。不同實(shí)驗(yàn)分組如下：A組：對(duì)照組，只加培養(yǎng)基；B組：20 μmol·L-1魚(yú)藤素；C組：30 mmol·L-1L-肌肽；D組：20 μmol·L-1魚(yú)藤素+30 mmol·L-1L-肌肽。作用24 h后，用PBS溶液洗滌2次，每孔加入1 mL的PBS。配制AO溶液 ∶EB溶液=1 ∶1的工作液，每孔加入20 μL工作液，室溫放置5 min。最后在熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，并拍照。

2.5AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種6孔板，每孔接種3 mL密度為5×107·L-1，均勻分布，在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁。次日除去舊培養(yǎng)基并加藥，實(shí)驗(yàn)分組情況同“2.3.2”。藥物作用24 h后，收集細(xì)胞液，并用PBS液洗滌2次，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，將細(xì)胞液重懸于EP管中，除去上清液，加入195 μL結(jié)合液和5 μL Annexin V-FITC混勻，混勻后加入10 μL PI，混勻液再次混勻，后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞ROS水平取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種6孔板，每孔接種3 mL密度為5×107·L-1，均勻分布。在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁。不同實(shí)驗(yàn)分組同“2.3.2”。24 h后收集細(xì)胞液，離心5 min，吸取上清液，用無(wú)血清培養(yǎng)基按1 000 ∶1比例稀釋10 mmol·L-1DCFH-DA母液，用1 mL稀釋液懸浮細(xì)胞，在37 ℃避光條件下孵育30 min，期間每隔5 min振蕩1次，離心后，PBS洗滌，PBS重懸細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞ROS水平。

3 結(jié)果

3.1L-肌肽對(duì)細(xì)胞存活率的影響如Fig 1所示，與對(duì)照組相比，藥物作用24 h后， 0～100 mmol·L-1的L-肌肽對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的存活率并沒(méi)有明顯影響，在最高濃度100 mmol·L-1時(shí)，其對(duì)細(xì)胞存活率的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果說(shuō)明，在0～100 mmol·L-1范圍內(nèi)，L-肌肽對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞沒(méi)有明顯的抑制作用。Holliday等[9]研究證實(shí)，20～50 mmol·L-1肌肽不僅不影響正常二倍體成纖維細(xì)胞的存活，而且還能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，故本實(shí)驗(yàn)選取低濃度3 mmol·L-1的L-肌肽與30 mmol·L-1的L-肌肽。

Fig 1 Effect of different concentrations of L-carnosine treated 24 h on viability of SH-SY5Y cells n=3)

如Fig 2 所示，藥物作用24后，3 mmol·L-1與30 mmol·L-1的L-肌肽和魚(yú)藤素共作用于SH-SY5Y細(xì)胞，能有效降低魚(yú)藤素對(duì)細(xì)胞的抑制作用。與魚(yú)藤素單獨(dú)作用的細(xì)胞的抑制率相比，3 mmol·L-1L-肌肽與20 μmol·L-1魚(yú)藤素對(duì)細(xì)胞的抑制率降低了5.01%(P<0.05)，30 mmol·L-1L-肌肽與20、50 μmol·L-1魚(yú)藤素對(duì)細(xì)胞的抑制率分別降低9.07%和6.1%(P<0.05)。結(jié)果表明，30 mmol·L-1L-肌肽能夠有效降低魚(yú)藤素對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的增殖抑制作用，保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞。

Fig 2 Effect of different concentrations of deguelin and L-carnosine treated 24 h on inhibitory rate of SH-SY5Y cells n=3)

**P<0.05,**P<0.01vs0 mmol·L-1L-carnosine group

3.2L-肌肽對(duì)細(xì)胞形態(tài)和凋亡的影響24 h后，細(xì)胞凋亡形態(tài)如Fig 3所示，30 mmol·L-1L-肌肽處理組，核內(nèi)染色質(zhì)均勻，細(xì)胞呈多邊形，少見(jiàn)明顯的凋亡特征。C組20 μmol·L-1魚(yú)藤素處理組，部分細(xì)胞表現(xiàn)出早期凋亡特征，細(xì)胞體積減小，核固縮呈新月?tīng)?。D組30 mmol·L-1L-肌肽和20 μmol·L-1魚(yú)藤素組，早期凋亡細(xì)胞數(shù)減少，表明L-肌肽能有效的降低魚(yú)藤素對(duì)細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。

3.3L-肌肽影響細(xì)胞凋亡率Tab 1、Fig 4結(jié)果顯示，與單獨(dú)魚(yú)藤素的C組相比，D組的早期凋亡率降低9.35%，總凋亡率降低10.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明L-肌肽可有效保護(hù)細(xì)胞，抑制細(xì)胞凋亡。

Fig 3 Apoptotic morphology of SH-SY5Y cells after treatment with deguelin and L-carnosine for 24 h with AO/EB double stained (×200)

A: Control group; B: 30 mmol·L-1L-carnosine treated group; C: 20 μmol·L-1deguelin treated group; D: 20 μmol·L-1deguelin and 30 mmol·L-1L-carnosine cotreated group. Arrows: apoptotic cell.

Tab 1 Apoptotic rate of SH-SY5Y cells after treatment with deguelin and L-carnosine for 24 n=3)

A: Control group; B: 30 mmol·L-1L-carnosine treated group; C: 20 μmol·L-1deguelin treated group; D: 20 μmol·L-1deguelin and 30 mmol·L-1L-carnosine co-treated group.*P<0.05vsgroup A;#P<0.05vsgroup C.

Fig 4 Apoptotic rate of SH-SY5Y cells after treatment with deguelin and L-carnosine for 24 h

A: Control group; B: 30 mmol·L-1L-carnosine treated group; C: 20 μmol·L-1deguelin treated group; D: 20 μmol·L-1deguelin and 30 mmol·L-1L-carnosine co-treated group.

3.4L-肌肽影響細(xì)胞的ROS水平如Fig 5所示，與對(duì)照組相比，30 mmol·L-1L-肌肽作用后，SH-SY5Y細(xì)胞的ROS水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。D組30 mmol·L-1L-肌肽和魚(yú)藤素共處理組，ROS水平較魚(yú)藤素單獨(dú)處理組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明L-肌肽的神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平實(shí)現(xiàn)的。

4 討論

SH-SY5Y細(xì)胞是一種分化程度較低的腫瘤細(xì)胞，衍生于人的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，其具有酪氨酸羥化酶、多巴胺羥化酶活性和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體, 因此，該細(xì)胞系被廣泛運(yùn)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制的研究，特別是應(yīng)用于PD發(fā)病機(jī)制的研究。本研究以SH-SY5Y細(xì)胞為模型，用CCK-8法檢測(cè)L-肌肽對(duì)細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，高濃度100 mmol·L-1的L-肌肽對(duì)細(xì)胞的增殖并無(wú)明顯的抑制作用，3、30 mmol·L-1的L-肌肽在一定程度上能有效降低魚(yú)藤素對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用，尤其是30 mmol·L-1L-肌肽對(duì)20 μmol·L-1魚(yú)藤素導(dǎo)致的細(xì)胞增殖抑制作用的效果最為明顯(細(xì)胞抑制率降低近10%)，故采用30 mmol·L-1L-肌肽與20 μmol·L-1魚(yú)藤素組進(jìn)行其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)AO/EB實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，與同濃度的單獨(dú)魚(yú)藤素組相比，30 mmol·L-1L-肌肽共處理組，細(xì)胞的形態(tài)得到改善，表現(xiàn)為早期凋亡數(shù)減少，說(shuō)明L-肌肽能夠降低魚(yú)藤素對(duì)細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。

Fig 5 Determination of ROS level of SH-SY5Y cells after treatment with deguelin and L-carnosine for 24 h

采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30 mmol·L-1L-肌肽共處理組比20 μmol·L-1魚(yú)藤素組細(xì)胞的早期凋亡率較小，降低9.35%，同時(shí)總凋亡率降低10.7%(P<0.05)，故可得知L-肌肽對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制細(xì)胞的凋亡實(shí)現(xiàn)的。

線粒體是氧化應(yīng)激的主要來(lái)源之一，因?yàn)樗醚鯕庾鳛槟芰?，產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。 ROS通常由緊密調(diào)節(jié)酶產(chǎn)生，如果過(guò)度刺激電子傳遞鏈將會(huì)導(dǎo)致ROS的過(guò)量產(chǎn)生。ROS涉及許多疾病，包括線粒體蛋白質(zhì)的改變，線粒體脂質(zhì)和線粒體DNA，這些疾病將導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是許多病因的主要原因，包括PD和阿爾茨海默病。研究者發(fā)現(xiàn)幾個(gè)與PD有關(guān)的基因涉及到線粒體的功能，神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的原因可能是線粒體功能障礙[10]。Dexter等[11]認(rèn)為，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致PD的主要原因之一。之前研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)藤素存在神經(jīng)毒性是因?yàn)槠渥饔糜诩?xì)胞的同時(shí)，抑制了線粒體復(fù)合體I，線粒體復(fù)合體I被抑制后，電子傳遞鏈將無(wú)法進(jìn)行，導(dǎo)致ROS水平升高[12]。本研究采用DCFH-DA染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同組的細(xì)胞ROS水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，30 mmol·L-1L-肌肽組作用于SH-SY5Y細(xì)胞后的 ROS水平較低(P<0.05)，其中，30 mmol·L-1L-肌肽和魚(yú)藤素共處理組，ROS水平較魚(yú)藤素單獨(dú)處理組低(P<0.05)，表明L-肌肽保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞毒性的機(jī)制可能是通過(guò)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。

本研究證實(shí)，L-肌肽主要通過(guò)抗氧化機(jī)制來(lái)降低細(xì)胞的神經(jīng)毒性，與魚(yú)藤素聯(lián)用時(shí)，可以降低魚(yú)藤素誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，這為進(jìn)一步研究魚(yú)藤素神經(jīng)毒性和尋找降低魚(yú)藤素毒性的方法提供了依據(jù)。