楊柳青，孔登，王雪耘，王曉紅，孟麗，王小柯

(濰坊醫(yī)學院 生物化學與分子生物學教研室，山東 濰坊 261053)

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融合基因VH-mms13的構建及其蛋白表達鑒定

楊柳青，孔登，王雪耘，王曉紅，孟麗，王小柯Δ

(濰坊醫(yī)學院 生物化學與分子生物學教研室，山東 濰坊 261053)

目的 構建原核表達載體pET30a(+)-VH-mms13，誘導表達后鑒定融合蛋白表達。方法 分別擴增單克隆抗體基因的重鏈可變區(qū)VH基因和細菌磁小體膜蛋白基因mms13基因，采用重疊延伸PCR技術(splicing by overlap extension，SOE-PCR)構建融合基因VH-linker-mms13，并將融合基因插入pET30a(+)載體，酶切、測序驗證；將重組質(zhì)粒導入大腸桿菌DE3中，0.4 mmol/L異丙基疏代半乳糖苷(Isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)誘導表達，產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western blot雙重鑒定。結果 PCR鑒定構建的融合基因VH-mms13大小為738 bp，與理論值相符，測序結果表明序列無誤；轉入DE3經(jīng)IPTG誘導，在包含體中檢測到融合蛋白表達；Western blot結果顯示該表達蛋白可與His-tag抗體特異性結合，蛋白大小符合融合蛋白理論預期。結論 成功構建了融合基因VH-mms13的表達載體pET30a(+)-VH-mms13，且融合蛋白反應原性良好，為生物磁靶向藥物的研發(fā)奠定了基礎。

VH；mms13；重疊延伸PCR；融合蛋白

Ⅳ型膠原酶在腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞中高度表達，其能夠降解細胞外基質(zhì)的主要成分Ⅳ型膠原，在腫瘤早期侵襲轉移中起重要作用[1]?，F(xiàn)階段關于抗Ⅳ型膠原酶單克隆抗體(McAb 3G11)及其單鏈抗體(ScFv)的研究較多，發(fā)現(xiàn)相關目的基因能在原核表達載體中誘導表達，且目的蛋白能有效抑制腫瘤細胞生長[2-4]。隨著生物磁學及靶向藥物研究的逐步深入，趨磁性細菌成為研究熱點。相對其他純培養(yǎng)的趨磁細菌而言，趨磁螺菌AMB-1有著氧耐受度高，易培養(yǎng)等優(yōu)點，且研究發(fā)現(xiàn)，在其磁小體眾多膜蛋白中，其特有的mms13作為膜表面錨定分子可成功地將綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)穩(wěn)定展示在磁小體表面，且檢測到的GFP強度遠遠大于其他膜蛋白分子，因此mms13是生物磁靶向的首選錨定基因[5-8]。實驗前期，本實驗室已成功從趨磁細菌AMB-1中克隆出目的基因mms13，構建了原核表達載體pET30a(+)-ScFv-mms13，并檢測發(fā)現(xiàn)融合蛋白與Ⅳ型膠原酶有較好的結合活性[9]?，F(xiàn)階段對于Ⅳ型膠原酶單鏈抗體的重鏈可變區(qū)研究較少，重鏈可變區(qū)形成的單域抗體與單鏈抗體相比，分子更小，理論上更易透過腫瘤細胞，起到抑制腫瘤細胞遷移的作用，而且在結構上看，通過基因工程改變的單域抗體在體內(nèi)更穩(wěn)定，且易被人體排除，對機體的損傷作用小[9-11]。因此，融合基因VH-mms13所表達的蛋白可能更適于生物磁靶向藥物的制備。

本研究擬通過融合基因表達技術，將磁小體膜蛋白基因mms13與在肝癌細胞中高度表達的Ⅳ型膠原酶單克隆抗體的重鏈可變區(qū)VH基因相偶聯(lián)，合成目的基因VH-mms13，構建原核表達載體pET30a(+)-VH-mms13，并經(jīng)異丙基疏代半乳糖苷(Isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)誘導表達，采用SDA-PAGE電泳和Western blot對融合表達蛋白進行初步鑒定，為生物磁靶向藥物的研究提供物質(zhì)基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌DH5α、Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞購自生工及康為世紀生物科技有限公司；pET30a(+)，pMD18-ScFv-mms13質(zhì)粒由本實驗室保存；pMD18-T Vector購自TaKaRa公司；NdeⅠ核酸內(nèi)切酶、XhoⅠ核酸內(nèi)切酶和T4連接酶均購自Thermo公司；PCR所用PCR Master mix購自BIO SCI；His-tag抗體及HRP標記山羊抗小鼠抗體購自康為世紀生物科技有限公司。

PCR引物序列由上海生工生物工程公司合成?；驕y序由南京金斯瑞生物公司完成。

主要實驗儀器有SW-CJ-1F凈化工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司)；AX224ZH電子天平(奧豪斯儀器上海有限公司)；T-Gradient PCR儀(德國Biometra公司)；HC-2518R高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；Gene Genius凝膠成像系統(tǒng)(美國SYNGENE公司)；JY92-2D超聲破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；PHS-3C數(shù)顯酸度計(上海宇隆儀器有限公司)；BS-1E振蕩培養(yǎng)箱(常州華普達教學儀器有限公司)；JY-SCZ2垂直電泳槽(北京君意東方電泳設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 融合基因VH-mms13的獲得：以pMD18-ScFv-mms13為模版，利用DNAMAN軟件設計2對特異性引物。A1上游引物序列：5′-GGAATTCCATATGCAGGTGAAGCTGCAG-3′(橫線部分為引入的酶切位點NdeⅠ)，A2下游引物序列：5′-GGATCCGCCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCGT-3′，用于擴增VH片段。B1上游引物序列：5′-GGCGGTGGCGGATC-CATGCCCTTTCACCTTG-3′，B2下游引物序列：5′-CCGCTCGAGGGCCAGTTCGTCCCG-3′(橫線部分為引入的酶切位點XhoⅠ)，用于擴增mms13片段。利用引物A1，A2；B1，B2分別擴增VH和mms13片段，產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，用重疊延伸PCR技術(splicing by overlap extension，SOE-PCR)將2個目的基因拼接，獲得融合基因VH-mms13。SOE-PCR反應條件：95 ℃變性30 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，1個循環(huán)后加入引物A1和B2各1 μL，繼續(xù)進行PCR反應，反應條件同上，進行31個循環(huán)，最后延伸10 min。

1.2.2 表達載體pET30a(+)-VH-mms13的構建：將SOE-PCR獲得的目的片段按照TaKaRa pMD-18T vector說明書操作，插入到T載體，獲得克隆載體pMD18-VH-mms13。以pMD18-VH-mms13為模板，A1、B2為引物，擴增目的基因VH-mms13。將PCR產(chǎn)物和pET30a(+)質(zhì)粒采用NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切，回收酶切后的產(chǎn)物，連接后轉化至E.coliDH5α。挑取單克隆進行PCR，NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，并測序驗證，獲得重組表達質(zhì)粒pET30a(+)-VH-mms13。

1.2.3 誘導表達VH-mms13融合蛋白：將重組質(zhì)粒pET30a(+)-VH-mms13轉化至大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞中，涂布于含40 mg/L卡那霉素和50 mg/L氯霉素的LB平板上過夜培養(yǎng)。挑取單菌落至20 mL含40 mg/L卡那霉素和50 mg/L氯霉素的液體LB培養(yǎng)基，37 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。取5份菌液，按3:100的接種量將菌液轉接至20 mL新的液體LB培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6左右，向菌液中分別加入IPTG，使終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，分別誘導1、2、3、4、5、6 h后取1 mL菌液離心，回收菌體，提取總蛋白。選擇最佳IPTG誘導濃度和最佳誘導時間。

1.2.4 VH-mms13融合蛋白表達鑒定：在1.2.3獲得的最佳誘導條件下，對誘導后的菌液經(jīng)離心、重懸、超聲破碎等處理，獲得細胞蛋白全細胞組分、上清液組分、細菌周質(zhì)腔組分、可溶細胞質(zhì)組分、包涵體組分。將每組蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳，觀察目的融合蛋白的表達形式。

1.2.5 Western blot檢測融合蛋白表達：將誘導表達的菌體全細胞組分蛋白樣品及其包涵體組分蛋白樣品各取10 μL，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉移至PVDF膜上，用含有5%脫脂奶粉的TBST封閉液室溫封閉2 h；TBST洗膜3次，每次10 min，加入一抗His-tag抗體(1:2000稀釋)，于4 ℃條件下孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，后加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG(1:2000稀釋)，于37 ℃條件下孵育1 h。TBST洗膜4次，每次10 min。ECL顯影、壓片，拍照觀察。

2 結果

2.1 融合基因VH-mms13的擴增 目的基因大小應為738 bp。SOE-PCR結果顯示獲得的融合基因大小與預期值大小相符。見圖1。

圖1 VH-mms13 PCR產(chǎn)物結果1、2、3：SOE-PCR產(chǎn)物；M：Marker 2000Fig.1 Results of VH-mms13 PCR amplification1,2,3:PCR products;M:Marker 2000

2.2 重組表達載體pET30a(+)-VH-mms13的鑒定 NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切和PCR擴增結果顯示：酶切后的片段在750左右，與PCR產(chǎn)物片段大小相近，見圖2。進一步測序結果顯示，插入片段大小為738 bp，與融合基因VH-mms13片段序列完全匹配，證明重組質(zhì)粒構建成功。

圖2 PCR產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物電泳結果1：重組質(zhì)粒NdeI/XhoI酶切產(chǎn)物；2：SOE-PCR產(chǎn)物；M：Marker 2000Fig.2 Results of restrictive enzymes digestion fragments and PCR product1:PCR product; 2:Products digested by NdeI/XhoI; M:Marker 2000

2.3 融合基因最佳誘導表達結果 實驗確定IPTG最佳誘導濃度為0.4 mmol/L，37°C條件下最佳誘導時間為6 h。在此條件下的SDS-PAGE凝膠電泳結果顯示：誘導菌中有明顯異源蛋白表達，而未誘導菌及空載對照菌，在此位置均無相應條帶。表達產(chǎn)物分量在25～35ku，與DNAMAN軟件計算理論蛋白分子量28 ku相符。見圖3。

圖3 融合蛋白SDS-PAGE結果1：重組質(zhì)粒pET30a(+) -VH-mms13轉化菌誘導表達；2：重組質(zhì)粒pET30a(+) -VH-mms13轉化菌未誘導表達；3：pET-30a(+)轉化菌；M：蛋白Marker Fig.3 SDS-PAGE of fusion protion1:Induced expression of recombinant plasmid; 2:Transformed bacteria without induction; 3:Negative control; M:Protein Marker

2.4 融合蛋白表達定位分析 SDS-PAGE電泳結果顯示：融合蛋白主要以包涵體形式存在，可溶細胞質(zhì)組分中幾乎沒有。包涵體中蛋白與誘導菌全細胞組分中目的蛋白大小一致，其分子量大小與理論值相符。見圖4。

圖4 融合蛋白表達結果1：包涵體組分；2：可溶細胞質(zhì)組分；3：細胞周質(zhì)腔組分；4：培養(yǎng)液上清組分；5：全細胞組分；M：蛋白MarkerFig.4 Determination of recombinant protein1:Inclusion body composition;2:Volume fraction of cytoplasm;3:Cell cycle mass fraction;4:Culture supernatant fraction;5:Whole cell component;M:Protein Marker

2.5 融合蛋白的Western blot檢測 誘導表達的菌體全細胞組分蛋白樣品及其包涵體組分蛋白樣品經(jīng)Western blot檢測，結果顯示，2者在相同的位置，均有特異性結合抗體的條帶。表明重組基因VH-mms13表達大小約為28ku的融合蛋白可以與His-tag抗體特異性結合，有相應的反應原性。見圖5。

圖5 融合蛋白Western blot 檢測結果1：包涵體蛋白；2：全細胞蛋白Fig.5 Indentification of fution protein by Western blot1:Inclusion body;2:Whole cell protein

3 討論

腫瘤嚴重危害人類健康，傳統(tǒng)的治療方法如手術、放療、化療對癌癥患者傷害較大。以抗EGFR藥物、抗HER-2藥物、抗VEGF藥物為主的分子靶向藥物，相對傳統(tǒng)的治療方法，針對性強，對人體的副作用小，但依舊有著不可忽略的局限性[12]。靶向治療作為一種新興的腫瘤治療手段，它的作用也因人而異[13-14]。此外，免疫細胞存活時間在體內(nèi)受限，尚需長期的規(guī)律治療。靶向治療還可能引起人體自身的免疫系統(tǒng)反應，出現(xiàn)低燒等副作用[15]?，F(xiàn)在臨床上，對于腫瘤的治療，尚缺乏有效的手段，新型腫瘤藥物的研發(fā)成為當前的熱點[16]。

本實驗將AMB-1趨磁細菌磁小體膜蛋白基因mms13與Ⅳ型膠原酶單克隆抗體的重鏈可變區(qū)基因VH，通過重疊延伸PCR技術(SOE-PCR)技術，合成目的基因VH-mms13。其片段大小為738 bp，編碼243個氨基酸，所形成的融合蛋白分子量小，更容易在各種系統(tǒng)中表達。由于缺失FC段，VH表達的小分子量蛋白更易與mms13表達的膜蛋白融合。理論上，融合蛋白本身含有VH所形成的單域抗體，穿透性更好，有利于蛋白在組織中的移動，并且可以結合一些普通抗體無法結合的隱蔽表位。以質(zhì)粒pET30a(+)為載體，構建原核表達載體pET30a(+)-VH-mms13，其轉錄及翻譯機制易調(diào)控，操作簡單易行。用IPTG在Rossta(DE3)大腸桿菌誘導表達，表達機制明確，短時間內(nèi)能實現(xiàn)融合基因VH-mms13的高效表達，形成的融合蛋白不易被菌體本身降解，而且蛋白本身帶有His-tag標簽，便于實驗后續(xù)過程中蛋白的純化分離。經(jīng)SDS-PAGE電泳及Western blot雙重檢測，原核表達載體pET30a(+)-VH-mms13表達出帶有His-tag標簽的融合蛋白，為生物磁靶向藥物的研究奠定了基礎。

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(編校：吳茜)

Construction of fusion gene VH-mms13 and identification of its protein

YANG Liu-qing, KONG Deng, WANG Xue-yun, WANG Xiao-hong, MENG Li, WANG Xiao-keΔ

(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Weifang Medical University, Weifang 261053, China)

ObjectiveTo construct the prokaryotic expression vector pET30a(+)-VH-mms13 and identification of its protein after induced with IPTG.MethodHeavy chain variable region VH gene of typeⅣcollagenase monoclonal antibody and magnetosome membrane protein gene mms13 were amplified separately,the fusion gene VH-linker-mms13 were synthesized by SOE-PCR technique and inserted into pET30a(+)plasmid,which was confirmed by restriction enzyme digest and sequencing.Then the recombinant plasmid pET30a(+)-VH-mms13 was transform intoE.coliDE3 and induced with 0.4 mmol/L IPTG.The fused protein was identified by SDS-PAGE and Western blot.ResultsThe length of fusion gene VH-mms13 was 738 bp,and the sequence was correct.After induced with IPTG,the fused protein was found in the inclusion body and Western blot results suggested that the fused protein can bind with His-tag antibody specifically. ConclusionExpression vector pET30a (+)-VH-mms13 is successfully constructed and the fusion protein has good immunogenicity,which lay the foundation for the development of biomagnetism-targeted drug.

VH; mms13; SOE-PCR; fusion protein

山東省科技攻關計劃(2009GG10002079)

楊柳青，男，碩士在讀，研究方向：趨磁細菌磁小體形成機制及應用研究，E-mail：815995018@qq.com；王小柯，通信作者，博士，教授，研究方向：趨磁細菌磁小體形成機制及應用研究，E-mail：wangxk@wfmc.edu.cn。

Q78

A

1005-1678(2015)12-0006-04