張夢云，嚴(yán)光,方文祥,沈國棟

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，a 老年醫(yī)學(xué)科，b 動物實驗室，合肥 230001；2.安徽省老年醫(yī)學(xué)研究所)

·基礎(chǔ)研究·

高脂飼養(yǎng)兔和豚鼠建立動脈粥樣硬化模型比較

張夢云1a，嚴(yán)光1a,方文祥1b,沈國棟2

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，a 老年醫(yī)學(xué)科，b 動物實驗室，合肥 230001；2.安徽省老年醫(yī)學(xué)研究所)

目的 比較高脂飼料喂養(yǎng)1個月的日本大耳兔和豚鼠的血脂變化及動脈粥樣硬化形成情況。方法 將12只兔和12只豚鼠分別采用數(shù)字表法隨機分成兩組，①兔對照組(n=6)：普通飼料喂養(yǎng)；②兔模型組(n=6)：高脂飼料喂養(yǎng)；③豚鼠對照組(n=6)：普通飼料喂養(yǎng)；④豚鼠模型組(n=6)：高脂飼料喂養(yǎng)。0周及4周末酶法檢測血脂;HE染色法觀察主動脈弓病理變化。結(jié)果 實驗4周末兔模型組和豚鼠模型組血清低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)均較對照組顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；病理結(jié)果示：兔模型組83%(5/6)可見動脈粥樣硬化早期病理改變，豚鼠模型組未見動脈粥樣硬化病理改變。結(jié)論 單純高脂飼料喂養(yǎng)1月，兔可形成高脂血癥和早期動脈粥樣硬化，豚鼠只可形成高脂血癥，兔較豚鼠快速形成動脈粥樣硬化模型。

動脈粥樣硬化；模型,動物;豚鼠；兔

動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥是嚴(yán)重危害人類健康的一類疾病，其發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚未明確。探明發(fā)病機制、研究篩選有效治療藥物是國內(nèi)外研究的重點和難點，而選擇合適有效的動物模型則是上述研究的重要前提。一個理想的模型應(yīng)該是建模時間相對較短，重復(fù)性好，操作方便，同時應(yīng)與人相似的病理改變，兔[1-2]和豚鼠[3]則符合上述要求，但究竟我們在選擇模型動物時要選擇哪一種更為恰當(dāng)呢？國內(nèi)鮮有對此方面進行比較，本文通過對比單位時間內(nèi)(1個月)高脂飼料飼養(yǎng)兔和豚鼠形成高脂血脂及早期動脈粥樣硬化的成模率，為將來模型的選擇提供參考意見。

1 材料和方法

1.1 動物 選取健康日本大耳兔、豚鼠各12只(購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物實驗許可證編號:scxk(魯)2014-0006。兔體質(zhì)量(2507.33±263.77)g，豚鼠體質(zhì)量(263.5±20.39)g，兔、豚鼠齡2～3月齡，兔單籠飼養(yǎng)，豚鼠分組飼養(yǎng)。12 h光照/黑暗，室溫控制于(24±1)℃，濕度45%～70%，通風(fēng)，防噪聲控制。飼料分為：普通兔/豚鼠飼料(安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)和高脂兔/豚鼠飼料(膽固醇 1%+蛋黃粉 7.5%+豬油 8%+膽酸鈉 0.5%+0.1%丙硫氧嘧啶+81%普通兔/豚鼠飼料)。

1.2 主要儀器 日立7060型全自動生化分析儀，LEICA EG1150H型組織包埋機，LEICA RM2235型石蠟切片機,OLYMPUS生物顯微鏡

1.3 實驗方法 實驗動物分組：適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，兔和豚鼠均采用隨機數(shù)字表法分成2組，兔分：對照組6只，普通飼料100 g/d；模型組6只，高脂飼料100 g/d；豚鼠分對照組6只，普通飼料自由飲食；模型組6只，高脂飼料自由飲食。上述動物均自由飲水，每日給予少許新鮮蔬菜。

血脂測定：在各動物入組前及實驗4周末，禁食過夜后次日清晨，靜脈采血，采血后靜置1 h后離心(3000 r/min×10 min，4 ℃),分離血清，在日立7060型全自動生化分析儀采用酶法檢測血清低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)、高脂血癥(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、極低密度脂蛋白(VLDL) 。

標(biāo)本采集及處理：實驗4周末，麻醉過量法處死動物，縱向分離升主動脈、主動脈弓、降主動脈、胸主動脈、腹主動脈至髂動脈的整條主動脈，縱向切開，觀察大體標(biāo)本病理改變后，置于10%福爾馬林中固定24 h后，乙醇梯度脫水，取主動脈弓行石蠟包埋，4 μm切片后行HE染色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料組間比較采用獨立樣本的t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般觀察 適應(yīng)性喂養(yǎng)時，各組實驗動物食欲、活動量、精神狀態(tài)一般，毛色、二便正常，且各組間無明顯差異，高脂喂養(yǎng)1周時各組之間無明顯變化，第2周末兔模型組中5只出現(xiàn)進食減少，活動量減少，表情淡漠等表現(xiàn)，兔對照組無此表現(xiàn)；第3周末豚鼠模型組出現(xiàn)較豚鼠對照組進食量減少，活動量稍減少，表情稍淡漠等表現(xiàn)，4周初1只豚鼠出現(xiàn)肺部感染，經(jīng)抗感染治療無效，死亡。

2.2 體質(zhì)量 入組時(0周)兔及豚鼠對照組與模型組間體質(zhì)量相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，4周末兔對照組體質(zhì)量較兔模型組偏低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，豚鼠對照組較豚鼠模型組高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組體質(zhì)量均值比較(g)

注：4周初豚鼠模型組中1只死亡，僅存5只；與對照組比較，aP<0.05

2.3 血脂 入組時(0周)兔及豚鼠對照組與模型組間TC、TG、LDL-C、HDL-C、VLDL-C水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗4周末兔模型組TC、LDL-C、HDL-C、VLDL-C均顯著升高，分別為健康對照組的17.7、29.2、4.2、25.8倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，模型組TG為對照組1.2倍，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；豚鼠模型組TC、LDL-C、HDL-C均顯著升高，分別為對照組的8.8、4.3、7.9倍，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，模型組TG、VLDL-C為對照組1.8、1.3倍升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2，3。

表2 兔實驗前后血脂變化

注：4周初豚鼠模型組中1只死亡，僅存5只；與對照組比較，aP<0.05

表3 豚鼠實驗前后血脂變化(mmol/L)

注：4周初豚鼠模型組中1只死亡，僅存5只；與對照組比較，aP<0.05

2.4 病理形態(tài)學(xué)變化 肉眼觀兔對照組全組主動脈質(zhì)韌，全程內(nèi)膜光滑、連續(xù)，未見異常改變；兔模型組中5只出現(xiàn)主動脈質(zhì)脆、厚薄不均，內(nèi)膜可見脂紋形成，1只未見明顯異常改變；豚鼠對照組及模型組均未見明顯異常改變。HE染色后光學(xué)顯微鏡下見兔及豚鼠對照組主動脈內(nèi)膜完整，內(nèi)皮細胞連接緊密，中膜由多層整齊排列的平滑肌細胞組成，細胞核多呈梭形(如圖1,2)。兔模型組主動脈內(nèi)膜及管壁明顯增厚，內(nèi)皮細胞不連續(xù)，單核細胞、巨噬細胞侵潤及聚集增加，大量的泡沫細胞聚集成斑塊,斑塊內(nèi)可見鈣鹽沉積，部分可見纖維帽形成(如圖3)；豚鼠模型組動脈內(nèi)膜增厚，內(nèi)皮細胞不連續(xù)，無單核巨噬細胞侵潤聚集，無泡沫細胞聚集等動脈粥樣硬化改變(如圖4)。

3 討論

目前研究常用的動物模型有兔、鼠、豬、非人靈長類、轉(zhuǎn)基因動物等，大鼠有抗AS的特性，且與人類脂質(zhì)代謝方式不一樣而很少應(yīng)用；豬和非人靈長類動物和人類的系統(tǒng)發(fā)育和飲食結(jié)構(gòu)相似，且有自發(fā)形成AS，是較理想的實驗動物，但其來源困難、費用昂貴和造模時間長等特點而不能廣泛應(yīng)用；兔在脂質(zhì)代謝方面與人類有一些相似之處，對高脂飼料敏感，是研究動脈粥樣硬化發(fā)病機制及治療藥物最常應(yīng)用的動物[4-5]；然而近幾年研究發(fā)現(xiàn)豚鼠與人類的脂代謝過程有許多相似之處，都是通過LDL攜帶和轉(zhuǎn)運大部分膽固醇的動物，其血漿脂質(zhì)構(gòu)成、膽固醇和脂蛋白的代謝方式與人類極為類似，豚鼠經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)后肝臟?；o酶A-膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(ACAT)和血漿膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)活性增強，這些均與人的變化相似[6-7]，故認(rèn)為豚鼠也是AS較理想的動物模型。

本實驗通過定期飼養(yǎng)兔和豚鼠1月，檢測血脂及主動脈病理變化，比較兩種模型動物的成模率及特點。實驗結(jié)果示實驗4周后兔模型組TC、TG、LDL-C、HDL-C分別為對照組的17.7、1.2、29.2、4.2倍，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，83%(5/6)的兔模型病理結(jié)果示早期動脈粥樣硬化，豚鼠模型組TC、LDL-C、HDL-C均顯著升高，分別為對照組的8.8、4.3、7.9倍，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，病理結(jié)果未見早期動脈粥樣硬化形成。故我們認(rèn)為在此配方的高脂飼料喂養(yǎng)1月，兔形成高脂血癥，成模率為100%，早期動脈粥樣硬化成模率為83%(5/6)；豚鼠也可形成高脂血脂，且成模率為100%，未能形成早期動脈粥樣硬化模型。

我國研究者在做相關(guān)研究時多以不同高脂飼料配比飼養(yǎng)兔數(shù)月，豚鼠則通常單純高脂飼養(yǎng)8～10周之后進行相關(guān)指標(biāo)測定和病理結(jié)果測定，如聯(lián)合球囊內(nèi)膜剝脫術(shù)或者免疫損傷則通常飼養(yǎng)8～10周[8-11]，但是球囊內(nèi)膜剝脫術(shù)手術(shù)復(fù)雜，術(shù)后死亡率較高，免疫損傷增加意外死亡風(fēng)險，而且機械性內(nèi)膜損傷和外源性免疫損傷不符合人體動脈粥樣硬化發(fā)生機制。李琳等[1]應(yīng)用配方為2%的膽固醇+10%豬油+0.2%丙硫氧嘧啶+87.8%普通飼料的高脂飼料喂養(yǎng)日本大耳兔10周，病理結(jié)果示早期動脈粥樣硬化，與本實驗比較可見延長對兔高脂喂養(yǎng)時間，血脂及動脈粥樣硬化病變都進一步發(fā)展，但血脂升高速度相對減慢；楊潤梅等[6]應(yīng)用高脂飼料(0.5%的膽固醇+10%豬油+89.5%普通飼料)喂養(yǎng)豚鼠10周后測定豚鼠血清TC，為健康對照組的9.7倍，病理結(jié)果示早期動脈粥樣硬化形成。與本實驗相比，豚鼠都出現(xiàn)高脂血癥結(jié)果一致，但在本實驗高脂配比下飼養(yǎng)1月，未見動脈粥樣硬化形成，如需建立動脈粥樣硬化模型則需進一步延長飼養(yǎng)時間。

綜上所述，兔在脂質(zhì)代謝方面和人類有一些相似之處，單純高脂飼料喂養(yǎng)符合人類動脈粥樣硬化發(fā)生過程，本實驗配比的高脂飼料喂養(yǎng)1月，形成高脂血癥和早期動脈粥樣硬化。在早期動脈粥樣硬化病理生理機制及藥物治療效果、選擇等研究中，為節(jié)約經(jīng)濟成本及時間，避免不必要的飼養(yǎng)時間可以選擇兔為模型動物；豚鼠血漿脂質(zhì)構(gòu)成、膽固醇和脂蛋白的代謝方式與人類極為相似，但是單純高脂飼料喂養(yǎng)1月，只可形成高脂血癥，長時間喂養(yǎng)增加動物意外死亡風(fēng)險，如實驗時間充裕、資金充足的研究者可以選擇豚鼠為模型動物。

(本文圖1～4見插圖5-1)

[1] 李琳,竇健霖,楚天舒，等.高脂飼料喂養(yǎng)加靜脈注射小牛血清白蛋白建立兔動脈粥樣硬化模型[J].中國組織工程研究，2012,16(20)：3690-3693.

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Atherosclerosis model comparsion between rabbits and guinea pigs feed by high fat diet

ZhangMengyun*,YanGuang,FangWenxiang,ShenGaodong

(*DepartmentofGeriatrics,AnhuiProvincialHospitalAffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China)

YanGuang,Email:yanguang399@sina.com

Objective To compare lipid changes and atherosclerosis of Japanese white rabbits and guinea pigs feed by high fat diet.Methods Twelve Japanese white rabbits and twelve guinea pigs were randomly divided into 2 groups respectively,1.Rabbit control group (n=6):chow diet;2.Rabbit model group (n=6):high fat diet;3.Guinea pig control group (n=6):chow diet;4.Guinea pig model group (n=6):high fat diet.Serum lipid were measured by enzymatic at 0 week and 4weeks.Aorta pathological changes were observed by HE staining.Results The total cholesterol,triglyceride,low density lipoprotein and high density lipoprotein of model groups were significantly higher than those in the control groups(P<0.05),and the difference was statistically significant.Pathology results showed that early stage pathological changes of atherosclerosis was founded in 83%(5/6) of rabbit model group,however there was no atherosclerosis in guinea pig model group.Conclusion Simple fed high-fat diet for 1month,rabbits will have hyperlipidemia and early atherosclerosis,while guinea pigs only with hyperlipidemia.The model of atherosclerosis could format repidly in rabbit compared with guinea pig.

Atherosclerosis;Models,animal;Guinea pigs；Rabbits

安徽省國際科技合作計劃項目(11030603025)

張夢云，碩士在讀，Email：272423119@qq.com

嚴(yán)光，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，Email:yanguang399@sina.com

R543.5

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2015.05.017

2015-05-10)