王 獻，喻 花，潘子昂，鄭飛燕

(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院， 武漢 430074)

超濾質(zhì)譜法研究人血清白蛋白與甘草提取物的相互作用

王 獻，喻 花，潘子昂，鄭飛燕

(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院， 武漢 430074)

為研究和篩選甘草提取物中的活性成分，采用超濾質(zhì)譜法(UF-MS)研究了人血清白蛋白和5種甘草提取物(甘草苷、甘草酸、甘草素、甘草呋喃酮和甘草利酮)的相互作用.結(jié)果表明：這5種甘草提取物均與人血清白蛋白有不同程度的結(jié)合，其中甘草酸的結(jié)合能力最強，其次是甘草苷、甘草素、甘草呋喃酮和甘草利酮.說明超濾質(zhì)譜法可準(zhǔn)確識別與受體蛋白質(zhì)結(jié)合的活性小分子配體，實現(xiàn)天然產(chǎn)物活性成分的快速篩選.

超濾質(zhì)譜；人血清白蛋白；甘草提取物；蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物

超濾質(zhì)譜技術(shù)是利用親和原理，將具有潛在活性的小分子化合物混合物與受體混合得到受體-配體復(fù)合物和未結(jié)合的小分子，濾除未結(jié)合的小分子后，用酸或有機溶劑處理復(fù)合物，釋放小分子配體，分離和鑒別活性分子.同光譜法[1]、電化學(xué)法[2]等相比，超濾質(zhì)譜法具有靈敏、快速、高通量，適用于從復(fù)雜體系中篩選活性成分的特點[3].

血清白蛋白在血漿含量最為豐富，它與內(nèi)源和外源性化合物結(jié)合后具有存儲和轉(zhuǎn)運的功能.烏拉爾甘草廣泛分布于我國北方地區(qū)，其干燥塊根與莖俗稱甘草，具有抗炎、抗病毒、抗過敏、抗氧化性、養(yǎng)胃、抗癌等藥用價值[4-10].本文以人血清白蛋白為靶點，通過超濾技術(shù)結(jié)合高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)從甘草中篩選出5種潛在的活性成分，應(yīng)用HPLC-MS鑒定分析了各組分結(jié)構(gòu)并比較了它們與HSA的結(jié)合能力的大小.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 6520四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀(Q-TOF MS, 美國安捷倫科技有限公司)，高效液相色譜儀(Agilent 1200, 美國安捷倫科技有限公司)，超濾膜 (YM-10, 美國Millipore 公司, 理論截取分子量10 kDa)，高速冷凍離心機(GL-20M, 上海盧湘儀離心機儀器有限公司)，紫外可見分光光度計(UV1700-1800, 上海鳳凰光學(xué)科技有限公司)，智能集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S, 上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司).

人血清白蛋白(HSA,美國Sigma)，甘草(湖北德仁堂大藥房)，纖維素酶(上海阿拉丁試劑)，甲醇、乙腈(色譜純, 德國Merck公司)，其他試劑均為優(yōu)級純.

1.2 儀器條件

質(zhì)譜條件和色譜柱參數(shù)詳見參照文獻[3]，液相色譜梯度洗脫條件流動相A為超純水，B為乙腈；t= 0 min，95% A (5% B)；t= 0～10 min，20% A (80% B)；t= 10～20 min，5% A (95% B)；t= 20～30 min，5% A (95% B)；t= 30～40 min，95% A(5% B).

1.3 甘草提取物的制備及超濾實驗

采用纖維素酶加超聲法提取甘草有效成分，經(jīng)一系列優(yōu)化實驗獲得最佳提取條件，此條件下提取甘草的有效成分得提取液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，用色譜純甲醇稀釋2倍，再用超純水稀釋500倍，得甘草提取物工作液，離心， 4℃下冷藏保存.將HSA溶解于超純水中，配制成100 μM的蛋白質(zhì)母液，用超純水稀釋5倍得20 μM工作液，離心，4℃下冷藏保存.提取物溶液與 HSA蛋白孵育后進行超濾實驗，進HPLC-MS分析，超濾實驗步驟詳見參考文獻[3].

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解-超聲提取法的優(yōu)化

本文對提取實驗條件進行了一系列的優(yōu)化，采用的酶解-超聲法提取甘草，以獲得最高提取率.通過逐一改變酶解超聲法的酶解溫度、溶液的pH值、酶解時間、乙醇浸泡時間和超聲時間，用紫外-可見分光光度法測定提取率，各實驗條件對提取率的影響如圖1所示.據(jù)圖1提取率-pH和提取率-溫度的變化趨勢，當(dāng)pH=4.5和酶解溫度為45℃時提取率最高；根據(jù)提取率-酶處理時間、提取率-乙醇浸泡時間和提取率-超聲時間的變化趨勢，處理時間越長則提取率越高，但時間到達一定程度時，變化趨勢變緩，本著經(jīng)濟、環(huán)保、省時的原則，選取酶處理時間為2.0 h，乙醇浸泡時間為1.0 h，超聲時間為30 min. 綜上，酶解-超聲法甘草的最佳條件如下：pH=4.5、酶解溫度為45℃，酶處理時間為2.0 h，乙醇浸泡時間為1.0 h，超聲時間為30 min.

a) pH; b) 溫度; c) 酶處理時間; d) 乙醇浸泡時間; e) 超聲時間圖1 酶解-超聲法提取甘草實驗條件的優(yōu)化Fig.1 The optimization of enzyme-ultrasonic exaction method for extracting licorice

2.2 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-ESI-MS)分析甘草提取物

用液質(zhì)聯(lián)用儀分析甘草提取物，首先優(yōu)化甘草提取物L(fēng)C-ESI-MS分析測試方法.采用ESI負離子模式，在優(yōu)化條件下對標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液進行分離檢測，利用化合物與C18柱固定相相互作用的強弱不同，出峰時間也不相同，極性大的先出峰，極性弱的后出峰，16 min內(nèi)甘草提取物混合溶液在C18柱中得到了完全分離，峰形較為對稱，結(jié)果見圖2.5種甘草提取物分子式、理論同位素分子量M及形成特征負離子質(zhì)荷比見表1.

表1 5種甘草提取物對應(yīng)的分子式、分子量和離子峰

n/a : not applicable

在總離子流圖中提取表1中5種提取物的分子量得到EIC圖(見圖2)，EIC圖中5組峰的ESI-MS質(zhì)譜圖(見圖3)對應(yīng)的特征負離子峰m/z分別為417.1241, 410.1984, 255.0708, 355.1289, 381.1391.將其與表1的理論值進行比對，鑒定這些峰分別為甘草苷、甘草酸、甘草素、甘草呋喃酮、甘草利酮.

1) 甘草苷; 2) 甘草酸; 3) 甘草素; 4) 甘草呋喃酮; 5) 甘草利酮圖2 5種甘草提取物提取離子流圖Fig.2 Extracted ion chromatogram (EIC) of five licorice extracts

圖3 EIC 中1～5號離子流峰對應(yīng)的ESI-MS質(zhì)譜圖 Fig.3 The corresponding ESI-MS spectra for 1～5 ion peaks in EIC

2.3 甘草提取物與人血清白蛋白的超濾實驗

超濾質(zhì)譜是一種基于質(zhì)譜的親和篩選方法，超濾過程在實驗中起關(guān)鍵作用.當(dāng)甘草提取物的混合溶液與靶蛋白混合時，活性成分小分子與靶蛋白形成復(fù)合物，被超濾膜截取下來，未結(jié)合的小分子可通過超濾膜離心洗脫.當(dāng)再加入有機溶劑使蛋白質(zhì)變性，蛋白-配體復(fù)合物發(fā)生解離，解離出的藥物分子超濾后進入液質(zhì)聯(lián)用儀分析，HPLC-MS檢測條件與標(biāo)準(zhǔn)溶液一致.在所得的總離子流圖(TIC)中提取5種甘草提取物精確分子量，結(jié)果見圖4.圖4中相同HPLC-MS檢測條件下，溶液中該物質(zhì)濃度與提取離子色譜峰的積分面積成正比，加入蛋白質(zhì)組的EIC色譜峰(實線)的信號強度均不同程度高于未加蛋白質(zhì)組(虛線).由二者提取離子色譜峰面積差異大小可知，甘草酸結(jié)合HSA能力較強，其次是甘草苷、甘草素、甘草呋喃酮和甘草利酮.

1) 甘草苷; 2) 甘草酸; 3) 甘草素; 4) 甘草呋喃酮; 5) 甘草利酮圖4 5種甘草提取物與HAS結(jié)合后的超濾質(zhì)譜提取離子流圖Fig.4 EIC spectrum of the 5 licorice extracts binding with HSA by ultrafiltration mass spectrometry

5種甘草提取物與HSA相互作用后溶液的超濾質(zhì)譜提取離子流圖(見圖4)中5組峰的ESI-MS質(zhì)譜圖(圖略)與標(biāo)準(zhǔn)溶液(圖2)一致，保留時間分別為10.300, 10.765, 12.113, 14.729, 15.355 min色譜峰的質(zhì)譜圖.通過Q-TOF MS給出的精確分子量信息確定，質(zhì)荷比m/z為417.1206的是甘草苷的[M-H]-峰，質(zhì)荷比m/z為273.1302、410.1942的是甘草酸的特征多電荷負離子峰，質(zhì)荷比m/z為255.0674的是甘草素的[M-H]-峰，質(zhì)荷比m/z為355.1280的是甘草呋喃酮的[M-H]-峰，質(zhì)荷比m/z為381.1361的是甘草利酮的[M-H]-峰.依據(jù)質(zhì)譜特征離子峰，按照保留時間鑒定該5種物質(zhì)依次為甘草苷、甘草酸、甘草素、甘草呋喃酮和甘草利酮，與標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液直接進ESI-MS分析的色譜峰保留時間一致.

3 結(jié)語

本文通過構(gòu)建超濾-HPLC-MS聯(lián)用檢測法研究了人血清白蛋白(HSA)與甘草提取物的相互作用，檢測出了與HSA有較強結(jié)合的5種有效成分：甘草苷、甘草酸、甘草素、甘草呋喃酮和甘草利酮，并通過比較提取離子流圖色譜峰確定了各成分與HSA結(jié)合能力的強弱.本研究以人血清白蛋白作為靶蛋白，親和超濾篩選后，將活性化合物分子從復(fù)雜的混合物中分離開來，用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析鑒定了有效成分，為研究和篩選中草藥有效成分提供了一種新方法.

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Study on the Interaction between Human Serum Albumin and Licorice Extracts by Ultrafiltration Mass Spectrometry

WangXian,YuHua,PanZiang,ZhengFeiyan

(College of Chemistry and Materials Science, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

In order to study and screen the active ingredient in licorice extract, the interaction between human serum albumin and 5 licorice extracts (liquorice glycosides, glycyrrhizic acid, licorice, licorice furfuran ketone and licoricone) were studied using ultrafiltration mass spectrometry (UF-MS). The results showed that all of the 5 licorice extracts could bind with human serum albumin (HSA). Among them, glycyrrhizic acid had the highest binding affinity, followed by liquorice glycosides, licorice, licorice furfuran ketone and licoricone. Our work demonstrated that UF-MS could accurately identify the small active molecule ligands of the receptor protein, thus rapidly screen active ingredients from natural products.

ultrafiltration mass spectrometry(UF-MS); human serum albumin (HSA); licorice; protein-drug interactions

2013-07-13

王 獻(1978- )，女，教授，博士，研究方向：質(zhì)譜分析，E-mail:xwang27@hotmail.com

國家自然科學(xué)基金資助項目(20705041, 21275167)，湖北省自然科學(xué)基金資助項目(2014CFA025)

TQ028；O657.63

A

1672-4321(2015)03-0025-04