宋發(fā)軍,于鵬飛,劉 佳,席曉圓,趙盛英,張 鵬

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074)

促進(jìn)種子萌發(fā)的重樓內(nèi)生菌的篩選

宋發(fā)軍,于鵬飛,劉 佳,席曉圓,趙盛英,張 鵬*

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074)

通過(guò)比較60株重樓內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液的水相提取液和有機(jī)相提取液對(duì)冬小麥種子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)8株細(xì)菌的有機(jī)相提取物具有促萌發(fā)作用.將其中4株細(xì)菌的發(fā)酵液依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，蒸干物用甲醇溶解并稀釋成不同濃度處理冬小麥種子.結(jié)果表明：腸桿菌屬74#菌的石油醚相提取物、不動(dòng)桿菌屬108#菌的氯仿相提取物、芽孢桿菌屬138#菌的氯仿相提取物和克雷白氏桿菌屬149#菌的乙酸乙酯相提取物的促萌作用較強(qiáng)(p<0.05)；其中芽孢桿菌屬138#菌的氯仿相提取物的1/2稀釋液的促萌作用最強(qiáng)(p<0.01).

重樓內(nèi)生菌；冬小麥種子；萌發(fā)；提取物

植物內(nèi)生菌是一類(lèi)多樣性豐富的微生物類(lèi)群，常生活在健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的細(xì)胞或細(xì)胞間隙內(nèi)，一般不引發(fā)宿主植物明顯感染.早在19世紀(jì)已分離得到內(nèi)生菌[1,2]，但目前，內(nèi)生菌的價(jià)值和作用并未獲得深入的研究和應(yīng)用[3,4].內(nèi)生菌對(duì)植物的生長(zhǎng)有重要影響，如感染內(nèi)生菌的植物一般較未感染的植株生長(zhǎng)更快，且人工接種某些內(nèi)生菌還能提高植物存活率，促進(jìn)發(fā)芽[1,2,5].

許多重要的藥用經(jīng)濟(jì)植物具有顯著的種子休眠特征，如重樓、圓柏種子等休眠時(shí)間長(zhǎng)，從播種到出土成苗需要約2年，是典型的“2年種子”[6].通過(guò)篩選能促進(jìn)種子萌發(fā)的內(nèi)生菌，利用其打破藥用植物種子的休眠，可為藥用植物的快速繁育奠定基礎(chǔ).本文以冬小麥種子為對(duì)象，分離重樓內(nèi)生菌的發(fā)酵液提取物并處理冬小麥種子，篩選可促進(jìn)種子萌發(fā)的內(nèi)生菌，并對(duì)菌株進(jìn)行了初步分類(lèi)鑒定，為獲得可有效打破種子休眠、促進(jìn)種子萌發(fā)的內(nèi)生菌及其產(chǎn)物的研究提供了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

冬小麥種子、重樓內(nèi)生菌由中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供，甲醇、無(wú)水乙醇、氯仿等(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠).

1.2 重樓內(nèi)生菌的分離和發(fā)酵液提取物的制備

參照文獻(xiàn)[7]，將重樓塊莖削除外皮后， 用0.1%升汞溶液處理5 min，75%酒精處理5 min，滅菌水清洗后，在超凈工作臺(tái)上切成1 cm2左右的小塊，接植在LB固體培養(yǎng)基平板上，室溫培養(yǎng)7d.每日觀察，將長(zhǎng)出的細(xì)菌分別挑至新的LB固體培養(yǎng)基平板上純化后進(jìn)行保種.將分離的內(nèi)生菌接種于100 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、190 r/min搖床培養(yǎng)7d后，超聲破碎10 min，5000 r/min離心15 min并收集上清液，即為發(fā)酵液[8].

1.3 促萌發(fā)內(nèi)生菌的初篩

將發(fā)酵液用等體積氯仿萃取，分別得有機(jī)相和水相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀分別蒸干水相和有機(jī)相.蒸干后水相固體用超純水定容至30 mL，有機(jī)相固體用1.5 mL分析純甲醇溶解，超純水定容至30 mL備用[9].冬小麥種子經(jīng)適量的滅菌水于37 ℃恒溫浸種12 h后，均勻放置在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中[10]，把不同內(nèi)生菌發(fā)酵液提取物加到對(duì)應(yīng)編號(hào)的培養(yǎng)皿中處理冬小麥種子，培養(yǎng)條件為：室溫、暗培養(yǎng).以含5%甲醇的超純水處理做對(duì)照，并參照文獻(xiàn)[8]，在第3, 5, 7 d觀察和統(tǒng)計(jì)冬小麥種子的發(fā)芽率.

1.4 促萌發(fā)內(nèi)生菌的復(fù)篩

將初篩獲得的菌株的發(fā)酵液，分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇(極性由小到大)進(jìn)行萃取得有機(jī)相萃取液，蒸干后分別用1.5 mL甲醇溶解，超純水定容至30 mL，分別得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取液原液，再用含5%甲醇的超純水分別進(jìn)行1/2、1/5梯度稀釋.將提取液原液和稀釋液依據(jù)1.3的方法處理冬小麥種子，以含5%甲醇的超純水處理做對(duì)照.每個(gè)濃度的處理實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3個(gè)平行重復(fù)，并在第3, 5, 7 d觀察并統(tǒng)計(jì)冬小麥種子的發(fā)芽率.

2 結(jié)果

本文從重樓塊莖共分離、純化獲得60株形態(tài)有差異的細(xì)菌.將其發(fā)酵液提取物分別處理冬小麥種子，結(jié)果(見(jiàn)表1)表明：不同內(nèi)生菌發(fā)酵液的水相提取物均不能促進(jìn)冬小麥種子的萌發(fā)，甚至存在一定的抑制作用，故復(fù)篩時(shí)不再對(duì)水相提取物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；而有機(jī)相提取物具有促進(jìn)冬小麥種子萌發(fā)的能力，其中74#、108#、114#、136#、138#、139#、147#、149#菌株的有機(jī)相提取物具有較明顯的促萌發(fā)作用(p<0.05)，在3, 5, 7 d檢測(cè)點(diǎn)的萌發(fā)率明顯高于其他菌株及對(duì)照處理(p<0.05).

表1 促進(jìn)冬小麥種子萌發(fā)的內(nèi)生菌的初篩結(jié)果

對(duì)初篩的8株菌進(jìn)行了基因組DNA的提取和16S rDNA的擴(kuò)增及測(cè)序分析，結(jié)果表明：74#、114#、139#菌株屬于腸桿菌屬(Enterobactersp.)，108#菌屬于不動(dòng)桿菌屬(Acinetobactersp.)，136#、138#、147#菌屬于芽孢桿菌(Bacillussp.)，149#菌屬于克雷白氏桿菌屬(Klebsiellasp.).

從4個(gè)菌屬中各選取一株促萌效果最好的菌株：74#、108#、138#、149#進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果(見(jiàn)表2)表明：74#菌落的石油醚相提取物(3, 7 d最大發(fā)芽率70%, 85%)，108#菌落的氯仿相提取物(3, 7 d最大發(fā)芽率71%, 83%)，138#菌落的氯仿相提取物(3, 7 d最大發(fā)芽率76%, 80%)，149#菌落的乙酸乙酯相提取物(3, 7 d最大發(fā)芽率62%, 86%)促萌發(fā)作用較強(qiáng)(p<0.05).各個(gè)有機(jī)相提取液的1/2稀釋液比原液和1/5稀釋液的促萌效果更好(p<0.05)： 3 d萌發(fā)率高出4%～38%； 5 d萌發(fā)率高出21%～29%； 7 d萌發(fā)率高出22%～28%.以3 d時(shí)的數(shù)據(jù)作為主要依據(jù)可見(jiàn)，138#菌株的氯仿相提取物的1/2稀釋液的促萌發(fā)作用最強(qiáng)(p<0.01, 見(jiàn)圖 1).

表 2 4株菌發(fā)酵液的4種有機(jī)相提取物對(duì)冬小麥種子萌發(fā)率的影響

注：PEE(petroleum ether extract):石油醚萃取物; CE(chloroform extract): 氯仿萃取物; EAE(ethyl acetate extract):乙酸乙酯萃取物; NBE(n-butanol extract): 正丁醇萃取物

-1：石油醚相提取液; -2：氯仿相提取液; -3：乙酸乙酯相提取液; -4：正丁醇相提取液**與CK(含5%甲醇的超純水處理)相比, p<0.01圖1 在3 d時(shí) 74#、108#、138#、149#菌株發(fā)酵液有機(jī)相提取物的1/2稀釋液對(duì)冬小麥種子的促萌效果Fig. 1 The promotive effcet of the half dilution of the organic phase solution extracted from the fermentation broth of strain 74#、108#、138#、149# on the germination of winter wheat seeds on the third day

3 結(jié)論

(1) 通過(guò)比較60株菌發(fā)酵液水相提取物和有機(jī)相提取物的處理結(jié)果，發(fā)現(xiàn)不同內(nèi)生菌發(fā)酵液的水相提取物均不能促進(jìn)冬小麥種子的萌發(fā)，而有機(jī)相提取物對(duì)冬小麥種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用，推測(cè)促萌發(fā)物質(zhì)居于有機(jī)相.

(2) 通過(guò)比較4株不同屬細(xì)菌的發(fā)酵液的有機(jī)相提取物對(duì)冬小麥種子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)不同屬內(nèi)生菌的有機(jī)相提取物的促萌發(fā)能力不同，腸桿菌屬74#的石油醚提取物、不動(dòng)桿菌屬108#的氯仿提取物、芽孢桿菌屬138#的氯仿提取物、克雷白氏桿菌屬149#的乙酸乙酯提取物的促萌發(fā)作用較強(qiáng).

(3) 通過(guò)比較3d時(shí)不同稀釋度的提取液對(duì)冬小麥種子的促萌發(fā)作用，發(fā)現(xiàn)138#菌落的氯仿相提取物的1/2稀釋液的促萌發(fā)作用最強(qiáng).

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Screening ofPolyphyllaEndophytes with Germination Effect

SongFajun,YuPengfei,LiuJia,XiXiaoyuan,ZhaoShengying,ZhangPeng

(College of Life Sciences, South-Central University for Nationalities, National Committee Key Laboratory for Biotechnology/Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application Special Plant Germplasm in Wuling Area of China ,Wuhan 430074, China)

The effect of the aqueous and organic extracts of the fermentation broths of 60Polyphyllaendophytic bacteria on the germination of winter wheat were compared. The organic extracts of 8 endophytes had germination effect and four fermentation broths from them were then extracted by petroleum ether, chloroform, ethyl acetate andn-butanol, respectively. The dried product was dissolved with methanol and diluted into different concentrations to treat the winter wheat seeds. The results showed that the petroleum-ether extract fromEnterobactersp. 74#, the chloroform extract fromAcinetobactersp. 108#, the chloroform extract fromBacillussp. 138#and the ethyl acetate extract fromKlebsiellasp. 149#had significant germination effect (p<0.05). The 1/2 dilution of the chloroform extract fromBacillussp. 138#had the best germination effect (p<0.01).

Polyphyllaendophyte; winter wheat seeds ; germination; extract

2014-10-07 *通訊作者 張 鵬(1977-)，男，博士，副教授，研究方向：藥用植物及其內(nèi)生菌, E-mail: zhangpenghust@126.com

宋發(fā)軍(1967-)，男，教授，研究方向：應(yīng)用生物化學(xué), E-mail:songfajun@scuec.edu.com

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31370118)，中南民族大學(xué)2014年碩士研究生學(xué)術(shù)創(chuàng)新基金(2014sycxjj112)

Q939.96

A

1672-4321(2015)03-0029-04