江莉莎，鄔亭亭，劉 平，張 莉，姚義勇，郭述良

分支桿菌噬菌體Leo生物學(xué)特性及抗結(jié)核作用

江莉莎1，鄔亭亭2，劉 平3，張 莉1，姚義勇1，郭述良1

目的 明確分支桿菌噬菌體Leo的生物學(xué)特性及其抗結(jié)核作用，為“雞尾酒療法”篩選候選噬菌體。方法 采用雙層平板法制備噬菌體Leo，觀察噬菌斑形態(tài)；電鏡觀察噬菌體顆粒形態(tài)；提取噬菌體DNA，限制性內(nèi)切酶酶切分析確定其核酸類型；以不同MOI擴(kuò)增噬菌體Leo，確定最佳MOI及最低MOI；通過一步生長曲線，確定潛伏期及裂解量；采用終點滴定反濁法測定恥垢分支桿菌對噬菌體Leo的耐受突變率；檢測噬菌體Leo對酒精、溫度的耐受性及在不同pH下的裂解能力；通過體外殺結(jié)核分枝桿菌實驗，明確噬菌體Leo對結(jié)核分枝桿菌的殺滅作用。結(jié)果 Leo噬菌斑圓形透明，邊緣清晰，含對稱的多面體頭部，直徑(70±3.0)nm, 可彎曲的尾部,尾長(211±31.7)nm；其基因組能被限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BglⅠ切開；最佳MOI為0.0 0001，最低MOI為0.0 001，潛伏期為150 min，裂解量74，耐受突變率為10-7。Leo對溫度、酒精敏感,在pH 7.4和pH 5.0時均能裂解宿主菌。Leo作用于結(jié)核分支桿菌72 h后，Leo組菌量明顯低于空白組(P<0.05)。結(jié)論 分支桿菌噬菌體Leo屬長尾噬菌體科，雙鏈DNA噬菌體，能夠殺滅結(jié)核分支桿菌,可作為“雞尾酒療法”的候選噬菌體。

分支桿菌噬菌體Leo；生物學(xué)特性；結(jié)核分支桿菌

近年來，耐藥結(jié)核病的流行嚴(yán)重威脅了人類健康和生命，而廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)更加劇了這一威脅。噬菌體作為一種抗菌劑，具有特異性強、自我增殖快、來源廣等其他抗菌劑無法比擬的優(yōu)點，成為新型抗菌藥物研究的熱點之一。噬菌體療法現(xiàn)階段主要應(yīng)用于銅綠假單胞菌、乳酸菌等快生長菌導(dǎo)致的感染，而諸如結(jié)核分枝桿菌等慢生長胞內(nèi)寄生細(xì)菌的相關(guān)研究少有報道。目前此類研究主要的分枝桿菌噬菌體包括D29和TM4。彭麗[1-2]將分支桿菌噬菌體D29用于結(jié)核病的治療，取得了良好療效。但D29已進(jìn)行了專利注冊，且單一噬菌體的應(yīng)用易引起細(xì)菌對噬菌體耐藥變異，不利于噬菌體療法的發(fā)展及應(yīng)用，故需篩選多種噬菌體組成“雞尾酒制劑”，以期一定程度上降低耐藥變異的產(chǎn)生幾率[3]。鑒于此，本文對分支桿菌噬菌體Leo的生物學(xué)特性及其對結(jié)核分枝桿菌的殺滅作用進(jìn)行了研究，以論證其是否可為“雞尾酒制劑”的候選噬菌體之一。

1 材料與方法

1.1 菌種和噬菌體 恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis, MS) mc2155 (CMCC 93202)由中國藥品生物制品檢定所王國治教授饋贈。結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株購于重慶市胸科醫(yī)院，噬菌體Leo由加拿大拉瓦爾大學(xué) Félix d’Hérelle 噬菌體中心提供。

1.2 噬菌體Leo制備 取10 μL 噬菌體Leo原液，用phage buffer從10-1按10倍梯度稀釋到10-10。將各稀釋液與100 μL 恥垢分枝桿菌混合，于室溫下靜置15 min后，加入3 mL 7H9半固體培養(yǎng)基(BD，USA)震蕩混勻，再傾倒于已制備的 7H10 固體培養(yǎng)基(BD，USA)平皿上，冷卻凝固，于37 ℃下倒置培養(yǎng)。次日觀察噬菌斑形態(tài)及透明度。

1.3 電鏡 純化噬菌體顆粒，取20 μL噬菌體液滴于銅網(wǎng)上，待噬菌體自然沉降15 min后，加入20 μL 2%磷鎢酸于銅網(wǎng)上，染色10 min，自然干燥后電鏡觀察噬菌體形態(tài)。

1.4 噬菌體酶切分析 取10 mL噬菌體收集液，采用λ噬菌體提取試劑盒(北京艾比根公司)。按操作規(guī)程提取噬菌體DNA。采用限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ、BglⅠ(Canda，F(xiàn)ermentas Inc.)酶切噬菌體基因組。酶切反應(yīng)體系置于37 ℃水浴30 min后，進(jìn)行酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳(電壓80 V，時間90 min)，DNA maker為1 000～10 000 bp。根據(jù)所得酶切圖進(jìn)行噬菌體DNA類型分析。

1.5 最佳感染復(fù)數(shù)和最低感染復(fù)數(shù)測定 感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)是指初始感染時加入噬菌體量與宿主菌量的比值。按不同的MOI加入噬菌體和恥垢分支桿菌，7H9/7H10雙層培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)過夜，各點均作3份復(fù)板培養(yǎng)取平均值。采用平板菌落計數(shù)法測定宿主菌濃度。次日收集噬菌體，梯度稀釋測定滴度，以產(chǎn)生最高噬菌體滴度的MOI作為最佳感染復(fù)數(shù)。并以噬菌體感染恥垢分支桿菌24 h后全部宿主菌被裂解的最小MOI作為噬菌體最低MOI。

1.6 一步生長曲線 參考李明的研究方法[4]，按MOI為0.1加入噬菌體和恥垢分支桿菌，37 ℃溫育15 min后離心(13 000 g 1 min)去上清，再以7H9液洗滌2次并稀釋104倍，重懸沉淀，置于37 ℃搖床中震蕩培養(yǎng)(160 r/min)，開始計時。從0 min開始，每隔15 min取樣離心，收集上清測定噬菌體滴度，每個時間點均重復(fù)3次。0 min 時取樣100 μL 離心后沉淀與恥垢分枝桿菌混勻后鋪板，產(chǎn)生的噬菌斑數(shù)即為感染初期感染噬菌體的宿主菌數(shù)。以感染時間為橫坐標(biāo)，噬菌體滴度的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制一步生長曲線，并計算潛伏期和裂解量(裂解量 = 裂解末期噬菌體滴度/感染初期感染噬菌體的宿主菌數(shù))。同時，分別設(shè)無噬菌體宿主菌培養(yǎng)液和無宿主菌噬菌體培養(yǎng)液作為對照。

1.7 耐受突變率 參考張劼的研究方法[5]，采用終點滴定反濁法測定噬菌體的耐受突變率，將恥垢分支桿菌(MS)連續(xù)10倍梯度稀釋(109～100CFU/mL)，取1 mL分別加入無菌試管，再加入100 μL噬菌體，靜置15 min后，置于37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)，觀察72 h各管反濁情況。此時，用接種環(huán)蘸取各濃度菌液劃線培養(yǎng)，72 h后觀察是否有菌落長出及菌落形態(tài)，以驗證反濁實驗結(jié)果。

1.8 噬菌體對理化因素的穩(wěn)定性

1.8.1 噬菌體的熱穩(wěn)定性 將噬菌體原液(8.7×1010PFU/mL)置于恒溫水浴箱中，分別于60 ℃、70 ℃保溫，每隔10 min取樣，冷卻至室溫，經(jīng)適當(dāng)稀釋后，雙層平板法測定噬菌體滴度,并計算存活率(存活率=加熱后噬菌體滴度/加熱前噬菌體滴度×100%)。

1.8.2 噬菌體的酒精穩(wěn)定性 將噬菌體原液10 μL(2.1×1010PFU/mL)加入990 μL 75%酒精中，同時以10 μL噬菌體原液加990 μL ddH2O作為對照。每隔10 min分別取樣，經(jīng)適當(dāng)稀釋后，雙層平板法測定噬菌體滴度，并計算存活率(存活率=酒精處理組噬菌體滴度/對照組噬菌體滴度×100%)。

1.9 噬菌體在不同pH環(huán)境中的裂解能力 將7H9半固體培養(yǎng)基的pH值調(diào)至7.4和5.0,取等量研磨均勻的恥垢分支桿菌兩份，分別與不同pH值的7H9半固體培養(yǎng)基混勻后，傾倒于已制備的7H10固體培養(yǎng)基上，制成菌苔。將Leo噬菌體液從1010PFU/mL 10倍梯度稀釋到103PFU/mL，取5 μL各稀釋液分別滴至不同pH值的菌苔上。37 ℃培養(yǎng)過夜，觀察有無噬菌斑形成。

1.10 噬菌體體外殺結(jié)核分支桿菌實驗 在盛有10 mL 7H9液體培養(yǎng)基的試管中，加800 μL研磨均勻的對數(shù)期結(jié)核分支桿菌H37Rv，并隨機(jī)分成兩組，實驗組中加入200 μL的Leo噬菌體(2.01×1010PFU/mL)，對照組中加入等量的ddH2O,放入搖床中37℃160 r/min震蕩培養(yǎng)，每組設(shè)4個復(fù)管。分別在培養(yǎng)第0 h、24 h和72 h時，吸取100 μL菌液，按10倍梯度稀釋至10-10，每個梯度取100 μL稀釋液接種于羅氏培養(yǎng)管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)，每天觀察其生長情況，30 d停止觀察，進(jìn)行菌落計數(shù)，并計算細(xì)菌濃度。

1.11 統(tǒng)計處理 各組間差異性比較采用SPSS 19.0軟件(SPSS Inc.，USA)中兩獨立樣本t檢驗(P<0.05)模塊進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌斑形態(tài)及噬菌體顆粒形態(tài) 由圖1可見噬菌體Leo噬菌斑圓形透明，邊緣清晰，平均直徑約為1.5 mm，呈裂解性噬菌體的特征。由電鏡觀察可見(圖2)，噬菌體Leo有一對稱的多面體頭部，直徑70±3.0 nm, 尾部可彎曲但不可收縮，尾長211±31.7nm，屬于長尾噬菌體科(Siphoviridae)[6]。

圖1 Leo噬菌斑形態(tài)

2.2 噬菌體酶切分析 限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BglⅠ能夠識別并切割雙鏈DNA分子特定的核苷酸序列，而Leo基因組可被這2種酶切開，因此噬菌體Leo基因組為雙鏈DNA(圖3)。

圖2 Leo電鏡觀察(×100 000)

1: BglⅠ; 2: Hind Ⅲ; 3: Genome of Leo; 4: DNA maker.

2.3 最佳感染復(fù)數(shù)和最低感染復(fù)數(shù)測定 噬菌體Leo以不同的MOI分別感染恥垢分支桿菌后，檢測子代噬菌體的滴度，結(jié)果見表1。當(dāng)MOI為0.0 0001時，噬菌體產(chǎn)量最高(1.8×1010PFU/mL)。因此，可確定噬菌體Leo的最佳感染復(fù)數(shù)為0.000 01。另據(jù)表1，噬菌體感染恥垢分支桿菌24 h后平板完全透明，恥垢分支桿菌裂解完全，故確定使恥垢分支桿菌裂解完全的最低感染復(fù)數(shù)為0.000 1。

2.4 一步生長曲線 從噬菌體吸附細(xì)菌開始，到細(xì)菌釋放新的噬菌體為止稱為潛伏期；平均每個受感染細(xì)菌所釋放的新噬菌體數(shù)稱為裂解量。以感染時間為橫坐標(biāo)，噬菌體滴度的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制一步生長曲線(圖4)。曲線顯示噬菌體感染宿主菌150 min后，噬菌體滴度開始上升。故噬菌體Leo的潛伏期為150 min，裂解量為74。

2.5 耐受突變率 將噬菌體分別加入各濃度恥垢分支桿菌(MS)菌液后，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，菌液稍變澄清后又開始由高濃度逐漸反濁，最低濃度反濁管細(xì)菌濃度為107CFU/mL。此時用接種環(huán)蘸取各濃度梯度菌液劃線培養(yǎng)，觀察長出菌落的各試管中最低濃度也為107CFU/mL，與反濁情況一致。根據(jù)終點反濁法，耐受突變率為最低濃度反濁管的細(xì)菌量的倒數(shù)。因此，噬菌體Leo的耐受突變率=1/(107CFU/mL×1 mL)=10-7。

表1 最佳感染復(fù)數(shù)檢測

圖4 一步生長曲線

2.6 噬菌體對理化因素的抵抗力 噬菌體Leo對熱敏感，60 ℃恒溫加熱10 min后噬菌體滴度由8.7×1010PFU/mL降至1.3×105PFU/mL，存活率低于1%，但加熱時間延長至20 min,仍有噬菌體存活(1.2×104PFU/mL)。而當(dāng)噬菌體Leo 70 ℃恒溫加熱10 min時，幾乎無噬菌體存活。噬菌體Leo對75%酒精亦十分敏感，作用10 min后無噬菌體存活。

2.7 噬菌體在不同pH環(huán)境中的裂解能力 結(jié)核分支桿菌是胞內(nèi)寄生菌，進(jìn)入人體后會被巨噬細(xì)胞吞噬。人體血液pH值為7.35～7.45，而巨噬細(xì)胞內(nèi)pH值為5.0。實驗證實，不管在高濃度還是低濃度，噬菌體Leo均能在pH 7.4及pH 5.0環(huán)境中裂解恥垢分支桿菌，形成噬菌斑(圖5)。據(jù)此初步推測噬菌體Leo不僅能裂解血液中的結(jié)核分支桿菌，還能裂解巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分支桿菌。

注：噬菌體滴度從左到右分別為(第一排)1010、109、108和107，(第二排)106、105、104和103。

2.8 噬菌體體外殺結(jié)核分支桿菌實驗 噬菌體Leo作用于結(jié)核分支桿菌72 h，分別檢測0 h、24 h和72 h Leo組與空白組菌量。由表2可知，0 h和24 h時，Leo組與空白組差異不明顯(P>0.05)，無統(tǒng)計學(xué)意義；而72 h時，Leo組與空白組差異明顯(P<0.05)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。由此可知，當(dāng)兩組細(xì)菌起始濃度相同時，噬菌體Leo作用72 h后對結(jié)核分支桿菌有一定殺滅作用。

3 討 論

2010年全國第5次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告顯示：全國15歲及以上人群活動性肺結(jié)核的患病率為459/10萬，其中涂陽肺結(jié)核患病率為66/10萬，耐多藥率高達(dá)6.8%[7]。耐多藥結(jié)核及廣泛耐多藥結(jié)核的增多，使噬菌體療法重新進(jìn)入人們的視線。本研究中噬菌體Leo噬菌斑清晰透明，呈裂解性噬菌體的特征。噬菌體療法是基于烈性噬菌體侵入宿主菌后可引起宿主細(xì)胞裂解這一特性建立的。因此，噬菌體Leo滿足噬菌體療法的基本要求。

表2 Leo體外裂解結(jié)核分支桿菌不同時間點菌量

# 實驗組與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

Note: # Experimental group was statistically different from control group (P<0.05).

噬菌體Leo基因組能被限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BglⅠ切開，表明其為雙鏈DNA。目前發(fā)現(xiàn)的分枝桿菌噬菌體均為含雙鏈DNA的有尾噬菌體[6]。大部分(71株)屬長尾噬菌體科，尾長，可彎曲但不可收縮；少數(shù)(9株)屬肌尾噬菌體科，具有可收縮的尾部[6]。本研究經(jīng)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，噬菌體Leo尾部可彎曲不可收縮，尾長約211 nm,表明其屬長尾噬菌體科。研究表明，具有較長卷尺蛋白(>1 100 aa)的噬菌體，含有motif3基序，能夠裂解休眠結(jié)核分支桿菌[8-9]。而卷尺蛋白氨基酸序列長度與噬菌體尾長是成正相關(guān)的[10-11]。一般來說，卷尺蛋白每增加一個氨基酸，噬菌體尾部長度增加0.15 nm[11]。根據(jù)噬菌體Leo尾長211 nm,推測其卷尺蛋白大于1 100 aa，含有motif3基序，能夠裂解休眠結(jié)核分枝桿菌。而D29尾部較短約129 nm[12]，卷尺蛋白長837 aa,不含motif3基序，不能裂解休眠結(jié)核分枝桿菌[9]。休眠結(jié)核分枝桿菌對Rif、INH這些一線抗結(jié)核藥耐藥，是結(jié)核病病程長、易復(fù)發(fā)、遷延不愈的原因。噬菌體Leo對休眠結(jié)核分支桿菌的潛在裂解力為潛伏結(jié)核病治療提供了新思路。

噬菌體一步生長實驗的前提是保證1個噬菌體吸附1個宿主菌,所以本實驗選擇的感染復(fù)數(shù)是0.1。通過一步生長曲線得知，噬菌體Leo的潛伏期為150 min，較其他種類噬菌體的潛伏期長。如銅綠假單胞菌φKMV的潛伏期為12～13 min[13],乳酸菌噬菌體φps05的潛伏期為34 min[14]。噬菌體一步生長周期與宿主菌、環(huán)境條件等密切相關(guān)。分支桿菌生長速度緩慢，恥垢分支桿菌雖是快生長分支桿菌，但較銅綠假單胞菌及乳酸菌生長速度仍緩慢，可能是導(dǎo)致噬菌體Leo潛伏期長的原因。噬菌體侵染同一宿主菌時，若吸附快、潛伏期短，則溶菌周期短，因此認(rèn)為潛伏期短的噬菌體更優(yōu)。前期研究測得10株分支桿菌噬菌體潛伏期為120～210 min不等，而噬菌體Leo的潛伏期為120 min，在分支桿菌噬菌體中是較短的，具有較好的應(yīng)用前景。

噬菌體療法需要擴(kuò)增大量的噬菌體，噬菌體Leo最佳感染復(fù)數(shù)為0.000 01，此時子代噬菌體產(chǎn)量可達(dá)1.8×1010PFU/mL，可以為噬菌體療法提供大量的噬菌體。且Leo的最低感染復(fù)數(shù)為0.000 1，表明噬菌體Leo對恥垢分支桿菌極度易感。[15]噬菌體在制備過程中，需注意實驗室的生物安全問題。噬菌體Leo對溫度、酒精均敏感，70 ℃加熱10 min 或 75%酒精處理10 min即可將噬菌體Leo全部殺死，因此可以利用高壓滅菌的方式消毒廢棄物，用75%酒精作實驗室日常消毒。

結(jié)核分支桿菌是胞內(nèi)寄生菌，當(dāng)其由呼吸道進(jìn)入人體后，會迅速被血液中的巨噬細(xì)胞吞噬。通常認(rèn)為殺滅巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌，是抗癆治療成功的關(guān)鍵。人體血液中pH環(huán)境為7.35～7.45，巨噬細(xì)胞中pH環(huán)境為5.0。噬菌體Leo在pH 7.4和pH 5.0 環(huán)境中均能侵入宿主菌形成噬菌斑，初步推測它能裂解血液和巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分支桿菌。而噬菌體TM4 在pH 5.0時不能裂解宿主菌，需要以恥垢分支桿菌為載體來殺滅巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分支桿菌[16]，因此，能在pH 5.0環(huán)境中裂解宿主菌是噬菌體Leo的一大優(yōu)勢。一般來說，大部分分支桿菌噬菌體都能裂解快生長分支桿菌，如恥垢分支桿菌，僅有少數(shù)分支桿菌噬菌體(如D29、TM4)能裂解慢生長分支桿菌，如結(jié)核分支桿菌。因此，本研究通過噬菌體對結(jié)核分支桿菌的體外殺菌實驗，探討噬菌體Leo對結(jié)核分支桿菌是否具有直接殺菌作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，作用72 h后Leo對結(jié)核分支桿菌有明顯殺菌效應(yīng)。

噬菌體Leo具有潛伏期短、對宿主菌易感、能直接殺滅結(jié)核分支桿菌以及在巨噬細(xì)胞內(nèi)能保持裂解力等特點，可以用于噬菌體療法，作為“雞尾酒制劑”的候選噬菌體。

[1]Peng L, Luo YA, Chen BW, et al. Therapeutic effect of bacteriophage D29 in the treatment for guinea pigs infected with sensitive strain ofMycobacteriumtuberculosis[J]. Chin J Zoonoses, 2009, 25(8): 733-736. (in Chinese) 彭麗，羅永艾，陳保文,等.噬菌體D29對感染敏感株結(jié)核分枝桿菌豚鼠的療效[J].中國人獸共患病學(xué)報，2009, 25(8): 733-736.

[2]Peng L, Chen BW, Luo YA, et al. Utility of bacteriophage D29 in treatment of guinea pigs with resistant tuberculosis[J]. J Fourth Mil Med Univ, 2009, 30(17): 1576-1579. (in Chinese) 彭麗,陳保文,羅永艾,等.噬菌體D29對耐藥結(jié)核病豚鼠的治療作用[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2009, 30(17): 1576-1579.

[3]Goodridge LD. Designing phage therapeutics[J]. Curr Pharm Biotechnol, 2010, 11(1): 15-27. DOI:10.2174/138920110790725348

[4]Li M, Shen XD, Zhou YB, et al. Study on biological characteristics ofPseudomonasaeruginosaphage PaP1[J]. J Third Mil Med Univ, 2005, 27(9): 860-863. (in Chinese) 李明,申曉冬,周瑩冰,等.銅綠假單胞菌噬菌體PaP1生物學(xué)特性的研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2005, 27(9): 860-863.

[5]Zhang J, Luo YA, Isolation and biological characteristics of phages of carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii[J]. J Shanghai Jiaotong Univ Med Sci, 2012, 5(32): 589-593. (in Chinese) 張劼,羅永艾.耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌噬菌體的分離鑒定及其生物學(xué)特性[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2012,5(32):589-593.

[6]Hatfull GF. The secret life of mycobacteriophages[J]. Adv Virus Res, 2012. DOI: 10.1016/B978-0-12-394621-8.00015-7

[7]Technical Guidance Group of Fifth National TB Epidemiological Survey: The Office of the Fifth National TB Epidemiological Survey, The fifth national tuberculosis epidemiological survey in 2010[J]. Chin J Anititubere, 2012, 34(8): 485-508. (in Chinese) 全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組，全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室，2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告[J].中國防癆雜志，2012,34(8):485-508.

[8]Piuri M, Hatfull GF. A peptidoglycan hydrolase motif within the mycobacteriophage TM4 tape measure protein promotes efficient infection of stationary phase cells[J]. Mol Microbiol, 2006, 62(6): 1569-1585.DOI: 10.1111/j.1365-2958.2006.05473.x

[9]Dusthackeer A, Hassan VN, Kumar V. Tape measure protein having MT3 motif facilitates phage entry into stationary phase cells ofMycobacteriumtuberculosis[J]. Comput Biol Chem, 2008, 32(5): 367-369. DOI: 10.1016/j.compbiolchem.2008.03.016

[10]Pedulla ML, Ford ME, Houtz JM, et al. Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes[J]. Cell, 2003, 113: 171-182. DOI: 10.1016/S0092-8674(03)00233-2

[11]Pham TT, Jacobs-Sera D, Pedulla ML, et al. Comparative genomic analysis of mycobacteriophage Tweety: evolutionary insights and construction of compatible site-specific integration vectors for mycobacteria[J]. Microbiology, 2007, 153: 2711-2723. DOI: 10.1099/mic0.2007/008904.0

[12]Liu P, Wu TT, Luo YA, et al.Isolation and biological characteristics of mycobacteriophage Chy2[J]. J Third Mil Med Univ, 2012, 34(12): 1176-1180. (in Chinese) 劉平,郭述良,羅永艾,等.分枝桿菌噬菌體 Chy2 的分離及生物學(xué)特性[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2012,34(12):1176-1180.

[13]Lavigne R, Burkal'tseva MV, Robben J, et al. The genome of bacteriophage φKMV, a T7-like virus infectingPseudomonasaeruginosa[J]. Virology, 2003, 312(1): 49-59. DOI: 10.1016/S0042-6822(03)00123-5

[14]Yoon SS, Barrangou-poueys R, Breidt F Jr, et al. Detection and characterization of a lyticPediococcusbacteriophagefrom the fermenting cucumber brine[J]. J Microbiol Biotechnol, 2007, 17(2): 262-270.

[15]Niu DY. Use of bacteriophage to controlEsherichiacoliO157:H7 in cattle and their environment[D]. Dalian: Dalian University of Technology, 2009. (in Chinese) 牛冬燕.應(yīng)用噬菌體控制牛及其飼養(yǎng)環(huán)境中大腸桿菌 O157:H7 的研究 [D].大連理工大學(xué),2009.

[16]Broxmeyer L, Sosnowska D, Miltner E, et al. Killing ofMycobacteriumaviumandMycobacteriumtuberculosisby a mycobacteriophage delivered by a nonvirulent mycobacterium: a model for phage therapy of intracellular bacterial pathogens[J]. J Infect Dis, 2002, 186(8): 1155-1160. DOI: 10.1086/343812

Biological characteristics of mycobacteriophage Leo and its bactericidal effect onMycobacteriumtuberculosis

JIANG Li-sha1,WU Ting-ting2,LIU Ping3,ZHANG Li1,YAO Yi-yong1,GUO Shu-liang1

(1.DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China; 2.DepartmentofRespiratoryMedicine,theThirdPeople'sHospitalofChengdu,Chengdu610031,China; 3.DepartmentofRespiratoryMedicine,People'sHospitalofChangshouDistrict,Chongqing401220,China)

To investigate the biological characteristics of mycobacteriophage Leo and its bactericidal effect onMycobacteriumtuberculosisfor cocktail therapy, we observed mycobacteriophage plaques after amplifying phage by double-layer agar plate method. The morphological characteristics were observed by electron microscopy. Mycobacteriophage Leo DNA was extracted and then digested by restriction enzyme to identify the nucleic acid type. Leo was amplified in different multiplicity of infection (MOI) to find the optimal MOI and the minimum MOI. One step growth experiment was carried out to find the latent period and burst size of Leo. The frequency ofMycobacteriumsmegmatismutation treated with mycobacteriophage Leo was inspected by the endpoint titration test. The effect of temperature and alcohol on Leo survival was surveyed. The ability of Leo to crack host bacteria at different pH values was examined. The effect of Leo onMycobacteriumtuberculosiswas determined by bactericidal assay. Results showed that the Leo plaque was round and transparent with a diameter of 1.5 nm. Leo has an isometric head (70±3.0 nm in diameter) and a flexible tail (211±31.7 nm in length). Its genome could be digested by restriction enzyme ofHind Ⅲ andBglⅠ. The optimal MOI and the minimum MOI of Leo were 0.000 01 and 0.000 1, respectively. The mutation frequency was 10-7. The latent period was 150 min, and the burst size was 74. Leo could not only crack host bacteria in solid medium at pH 7.4 but also at pH 5.0. After 72 hours, the amount ofMycobacteriumtuberculosisin Leo group was less than that in control group (P<0.05). In conclusion, Leo has a bactericidal effect onMycobacteriumtuberculosisand could be a candidate of phage cocktails. Keywords: mycobacteriophage Leo; the biological characteristics;MycobacteriumtuberculosisSupported by the National Major Science and Technology Program in “Twelfth Five-year” Plan (No. 2012ZX10003009),National Key Clinical Specialty Foundation(No.2012-649)Corresponding author: Guo Shu-liang, Email: guosl999@sina.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.001

國家“十二五”重大專項課題(2012ZX10003009),國家臨床重點?？茖ｍ椊?jīng)費資助項目(No. 2012-649)資助， 江莉莎與鄔亭亭對本文同等貢獻(xiàn)

郭述良,Email：guosl999@sina.com

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 400016； 2.成都市第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，成都 610031； 3.重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 401220

R378.91

A

1002-2694(2015)03-0193-06

2014-07-30；

2014-12-11